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目的：以中医理论为指导,总结痛风病的中医认识、分析通痹汤的方义;观察通痹汤对模型动物的抗炎、镇痛及嘌呤代谢的影响并探讨机理;观察通痹汤含药血清对巨噬细胞功能的影响;观察含药血清对体液免疫和细胞免疫功能的影响;观察含药血清对CD4+T细胞亚型(Th1/Th2)的影响。
方法:
1.通过理论研究,阐述痛风病的病因病机、探讨其治则治法。
2.通痹汤镇痛作用的实验研究。
(1)观察药物对小鼠化学性痛的影响:通过醋酸诱发小鼠腹痛,观察各药物剂量组与盐酸吗啡组、空白组的扭体次数、扭体抑制率;
(2)观察药物对小鼠热性痛的影响:通过热板诱发小鼠热性痛,观察各药物剂量组与盐酸吗啡组、空白组的痛阈值;
3.通痹汤抗炎作用的实验研究
(1)观察药物对急性化学致炎症的影响:通过二甲苯注射制备小鼠耳肿胀模型,比较各药物剂量组与消炎痛组、空白组的肿胀抑制率;
(2)观察药物对急性炎症介质的影响:通过角叉菜注射制备大鼠足跖肿胀模型,比较各药物剂量组与醋酸地塞米松组、空白组的致炎后足跖肿胀率、组织渗出液炎性介质含量(Histamine、5-HT、PGE2);
(3)观察药物对慢性炎症的影响:通过皮下棉球植入制备大鼠慢性肉芽肿模型,比较各药物剂量组与醋酸地塞米松组、空白组的肉芽肿重量;
(4)观察药物对毛细血管通透性的影响:通过小鼠腹腔色素渗出实验,观察各药物剂量组与PNS组、空白组腹腔液的OD值。
4.通痹汤影响嘌呤代谢的实验研究。通过高核蛋白、高钙饲料饲服制备鸡痛风模型,以ELISA法检测,比较各药物剂量组与别嘌呤醇组、空白组血尿酸水平、粪便尿酸含量、血清黄嘌呤氧化酶(XOD)活性。
5.通痹汤对急性痛风性关节炎作用的实验研究。通过尿酸钠溶液注射制备大鼠急性痛风性关节炎模型,比较各药物剂量组与秋水仙碱组、空白组关节肿胀的影响、滑膜细胞因子表达。
6.通痹汤含药血清免疫调节作用研究。
(1)含药血清对固有性免疫的作用。以大鼠腹腔巨噬细胞为研究对象,观察药物对其功能的影响:免疫酶技术检测含药血清对sTNF诱导的巨噬细胞呼吸爆发现象的影响;实时荧光定量PCR检测含药血清对sTNF诱导巨噬细胞炎性细胞因子IL-1β、TNF-α mRNA表达的影响;激光共聚焦显微镜检测含药血清对sTNF诱导巨噬细胞NF-κB(P65)核转位的影响;小鼠碳粒廓清法检测含药血清对巨噬细胞吞噬功能的影响;
(2)含药血清对适应性体液免疫功能的作用:美洲商陆诱导的B淋巴细胞增殖实验、sRBC诱导的小鼠抗体应答实验;
(3)含药血清对适应性细胞免疫功能的作用:刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞增殖实验、DNCB-丙酮溶液诱导的迟发型超敏反应实验;
(4)含药血清对CD4+T细胞亚型(Th1/Th2)的影响:通过ELISA法检测不同时相关节滑膜囊细胞因子的种类和含量。
结果：
1.理论研究结果:脾虚不运、湿浊为患是痛风病的重要病机。
2.通痹汤镇痛作用的实验结果:
急性毒性实验确定用药安全剂量为:小鼠用药量:高剂量组25g/kg,中剂量组为12g,低剂量组为6g。大鼠用量约为小鼠剂量×0.7,即为高剂量组18g/kg、中剂量组为9g/kg、低剂量组为4g/kg;药物对醋酸诱发小鼠腹痛的影响结果显示治疗组低、中、高剂量组均可见扭体次数减少,与阴性对照组比较具明显差异(P＜0.001);热板法检测药物对小鼠热致疼痛作用的影响结果显示测得治疗组痛阈平均值与阴性对照组相比显著提高(P＜0.01);甲醛测痛实验结果显示通痹汤对甲醛致痛作用第一时相(即5min时)和第二时相(15min、30min)的疼痛反应评分值均出现降低。
3.通痹汤抗炎作用的实验结果:
二甲苯致小鼠耳肿胀实验结果显示各组与空白组比较均有显著性差异(P＜0.01～0.001)且呈现剂量相关性;角叉菜所致大鼠足跖肿胀实验结果显示致炎后1h,药物大剂量组;致炎后2h药物中、大剂量组;致炎后4h、6h药物大、中、小剂量组抑制率均大于30％,其中大剂量组在4小时左右抑制能力最强为50.31%;炎症组织渗出液内炎症介质含量测定结果显示治疗组组织渗出液内组织胺含量显著降低;药物高剂量组前列腺素2、5-HT含量显著降低(P＜0.05);小鼠腹腔色素渗出实验结果示各给药组均能降低依文思兰的吸光度(OD值);大鼠棉球植入实验结果显示,通痹汤中高剂量组可明显抑制大鼠肉芽组织增生(P＜0.001)。
4.通痹汤影响嘌呤代谢的实验结果:
鸡痛风症动物模型血尿酸水平的影响结果显示治疗组血尿酸值均显著降低,与治疗前相比均有显著性差异(P＜0.05),治疗后通痹汤高、中、低剂量组粪便中尿酸排泄量均显著增高,与治疗前相比均具显著性差异;对鸡痛风动物模型血清XOD活性的影响实验结果显示,各剂量组XOD活性降低,其中中、高剂量组与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)。低剂量组无显著差异。
5.通痹汤对急性痛风性关节炎作用的实验结果:
药物对大鼠尿酸钠诱发急性炎关节肿胀的影响实验结果显示在注射后的2h、4h、8h、12h、24h检测时段,药物治疗组肿胀率明显减小,药物组最高抑制率达68.6%(高剂量组,24小时)所用药物两剂量组之间的疗效无显著性差异。检测滑膜炎性细胞因子mRNA表达结果显示秋水仙碱组(阳性对照组)、治疗组IL-1β RT-PCR产物量明显低于生理盐水组。而通过密度扫描进行相对定量,证实治疗组的抑制效率为50%;治疗组Ⅰ和治疗组Ⅱ均可见TNF-α特异性RT-PCR产物条带显示,但产物表达量较生理盐水组明显减少。通过密度扫描进行相对定量,证实治疗组的抑制率为30%。
6.通痹汤含药血清免疫调节作用实验结果:
(1)含药血清对固有性免疫的作用:
结果显示10%浓度含药血清可明显抑制sTNF诱导巨噬细胞的呼吸爆发,而20%含药血清的抑制作用最强;检测含药血清对sTNF诱导巨噬细胞表达IL-1βmRNA和TNF-αmRNA的影响结果显示治疗组IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达明显降低;含药血清能抑制sTNF诱导大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB核转位现象,但不同剂量含药血清组间未见差异;单核吞噬细胞吞噬功能测定结果显示含药血清低剂量组和中药水剂低剂量组K值变化与生理盐水对照组比较没有统计学意义,而含药血清高剂量组和中药水剂高剂量组K值增加(P＜0.05)。
(2)含药血清对适应性体液免疫功能的作用:
淋巴细胞增殖实验结果显示含药血清对PWM诱导的B淋巴细胞增殖指数增高,提示有细胞增殖,但无统计学差异。(p＞0.05);测定含药血清对小鼠sRBC初次应答的水平的影响,将给药组与对照组平均HC50值进行t检验,结果显示,药物中、高剂量组HC50增高(*P＜0.05)。
(3)含药血清对适应性细胞免疫功能的作用:
淋巴细胞增殖实验结果可见不同浓度含药血清可剂量依赖性抑制T细胞增殖(p＜0.05);含药血清对DNCB诱导的迟发性超敏反应具有显著剂量依赖性的抑制作用。
(4)含药血清对CD4+T细胞类型(Th1/Th2)的影响:
ELESA检测不同时相细胞因子水平显示与正常组比较TNF随时间延长逐渐升高,在24h达高峰,此后逐渐下降。IL-2于造模12h始显著增高,48h后开始下降;造模24h IL-4,IL-13显著增高。与模型组比较,药物组TNF、IL-2表达显著降低,IL-4,IL-13显著增高(P＜0.05)。
结论：
1.正气不足,营卫不固,气血津液运行无力,气血阻滞,津枯痰凝是痛风病的重要病机。
2.通痹汤具显著镇痛、抗炎和调节嘌呤代谢紊乱的作用。
3.通痹汤可抑制关节局部炎症因子的表达从而缓解关节局部的组织损伤。
4.通痹汤可调节机体免疫应答水平。