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临床上许多以大量蛋白尿为主要表现的膜性肾病(MN)、局灶阶段性肾小球硬化(FSGS)等原发性足细胞病患者都伴有不同程度的肾小球脏层上皮细胞,即足细胞结构和功能的异常。目前糖皮质激素(GC)仍是临床上治疗足细胞病的主要药物,但激素的疗效并不非常确定,部分患者出现激素抵抗,影响临床缓解,然而影响激素敏感性的因素目前尚不完全确定。本实验分析足细胞病患者外周血单个核细胞(PBMC)中GRα的基因表达情况,同时在基础研究中构建足细胞损伤和修复模型,并应用miRNA干扰技术,探讨miR-30d是否对足细胞中GRα有靶向调控作用进而影响激素的敏感性,本实验从不同角度揭示足细胞病的本质,探索新的干预靶点和治疗方法。第一部分足细胞病患者外周血单个核细胞中GRα的表达分析目的:探讨足细胞病患者外周血中单个核细胞(PBMC)中GRα表达情况。方法:回顾性随机选取2013年3月至2016年2月于大连医科大学附属一院肾内科经肾组织活检术确诊为足细胞病的患者9例。包括微小病变(MCD,3例)、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS,3例)、膜性肾病(MN,3例)。分别记录入组患者的基线资料,即24小时尿蛋白定量、血白蛋白、肌酐、胆固醇等临床指标。留入组患者激素治疗前1周内晨空腹外周抗凝血,并提取外周血中单个核细胞(PBMC),q RT-PCR检测入组患者PBMC中GRα的基因表达情况,同时选择年龄、体重和患者相匹配的健康成人3例作为正常对照组。结果:按照纳入标准,随机收集9例患者资料。男性患者6例(占60%),女性3例(占40%),男女比例为1.5:1,各年龄段之间的差异无统计学意义(P>0.05);患者血压的均数为126/76mm Hg;体重均数为71.5Kg;发病时间均数为4.25个月。q RT-PCR结果显示:与对照组相比,微小病变、局灶性节段性肾小球硬化、膜性肾病患者组PBMC中的GRαm RNA的表达明显降低。结论:足细胞病患者PBMC中GRα的表达明显下降,可能与激素抵抗有关。第二部分miR-30d调控足细胞中GRα改善激素敏感性的研究目的:探讨miR-30d调控足细胞中GRα改善激素敏感性的分子机制。方法:体外培养的分化成熟的条件永生化小鼠足细胞系MPC5,瞬时转染mmu-miR-30d-5p Mimics及其阴性对照、mmu-miR-30d-5p Inhibitor及其阴性对照后,构建MPC5损伤模型:嘌呤霉素氨基核苷(PAN)4.5μg/m L,培养24h;MPC5损伤修复模型:地塞米松(DEX),1u M预处理后,在PAN损伤后DEX分别刺激0h、6h。实验分为正常对照组,PAN损伤组,DEX修复组。同批细胞,收集每组细胞后,提取RNA和蛋白质,q RT-PCR和Western blot分别检测GRα及其下游基因GILZ的基因和蛋白表达情况;免疫荧光显微镜进行MPC5的标志蛋白检测;激光共聚焦显微镜检测GRα的核转位情况;双荧光素酶报告系统检测miR-30d对融合GRαm RNA全长的双荧光素酶报告基因表达的影响,进一步研究miR-30d是否对GRα有直接靶向调控作用。结果:分化成熟的MPC5,转染mmu-miR-30d-5p Mimics及其阴性对照、mmu-miR-30d-5p Inhibitor及其阴性对照后,正常组,PAN损伤组,DEX修复组三组的组内比较,GRα及GILZ的基因和蛋白水平的表达差异均无统计学意义;组间比较:在PAN损伤组中GRα及GILZ的基因和蛋白表达水平均较正常组下降,DEX修复组中GRα及GILZ的基因和蛋白表达水平均较PAN组增加。双荧光素酶报告系统检测结果显示,miR-30d对融合预测靶基因GRαm RNA全长序列的双荧光素酶报告基因的表达没有明显影响。结论:糖皮质激素能减少PAN诱导的足细胞凋亡,但miR-30d对GRα并不存在直接的靶向调控机制。