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柑橘类水果作为全球第一大水果,世界范围内广泛分布。柑橘类水果营养价值、药用价值及保健价值较高,在人们日常生活中占有重要地位。柑橘鲜食和加工中,种子严重影响其果实品质和商业价值,果实无核一直是柑橘育种追求的目标。本实验室以无核突变体‘黔阳无核’椪柑为研究材料,以‘鄂柑一号’椪柑为对照,结合细胞学、遗传学分析‘黔阳无核’椪柑无核性状的成因。利用抑制差减杂交(SSH)文库结合定制芯片确定‘黔阳无核’及‘鄂柑一号’差异表达基因。同时,克隆了与‘黔阳无核’椪柑无核机理相关基因MSLP全长。本实验基于前人研究,选取MSLP基因为研究对象,初步探讨该基因的功能,主要研究结果如下:1.亚细胞定位采用酶切法构建亚细胞定位载体PBI121-MSLP-GFP,由Ca M35s强启动子启动MSLP及相连的GFP基因的表达,通过荧光显微镜观察荧光发生部位。实验以洋葱表皮为研究材料,通过根癌农杆菌介导法侵染洋葱表皮,结果发现只有洋葱表皮细胞核有荧光发生,表明MSLP基因定位于细胞核。2.酵母双杂交构建酵母双杂交BD-MSLP‘钓饵’载体,对BD-MSLP转化酵母并进行自激活检测和毒性检测发现其并无自激活和毒性。采用mating法对构建的目的‘钓饵’载体进行调库,通过测序成功获得了5个序列部分信息,在甜橙基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)进行比对,得到3个有效的基因信息,对3个基因表达蛋白进行初步分析发现其分别为:与转录调控相关的DNA结合蛋白、线粒体定位的低分子量热激蛋白、预测为热激蛋白Dna J蛋白家族成员蛋白。3.转基因烟草阳性苗获得及表型初步分析采用酶切法构建超表达载体p CAMBIA-1301-MSLP,利用农杆菌介导叶盘转化法将p CAMBIA-1301-MSLP导入烟草植株,在含有2.5 mg/L潮霉素的MS培养基上进行诱导生芽和筛选培养,待其生长到1 cm大小后切下放入生根培养基中培养,待根生长良好后转入培养土中放入温室生长至开花结实。为了确定目的基因是否导入烟草植株,提取转基因植株和野生型植株DNA,以p CAMBIA-1301-MSLP质粒为阳性对照,以野生型DNA为阴性对照,以潮霉素特异引物Hyg-F/R和目的载体MSLP-F/R引物分别进行PCR扩增,表明转基因植株在500 bp和1300 bp左右有明显亮带而野生型植株在该区域没有亮带,显示基因成功导入至烟草植株。共获得转基因植株16棵。对其表型进行初步分析发现,与野生型相比转基因植株在花和花粉的形态上没有明显差异,但3号植株花椭圆形不饱满花粉明显高于野生型,不饱满花粉达31.4%,卡宝品红花粉活力检测结果显示转基因烟草花粉活力正常。4.山金柑RNAi干涉利用gateway技术构建GRV-MSLP干涉载体,采用农杆菌介导山金柑上胚轴遗传转化法将GRV-MSLP载体导入到山金柑,在含有500 mg/L Kan的MT生芽培养基上分别进行诱芽和筛选培养,经2周暗培养之后转入光培养,每25 d继代一次。待愈伤处抗性芽长至≥0.5 cm,将其连同部分茎段一同切下转入MT伸长培养基进行伸长培养,每25 d继代一次。待抗性芽长至一定大小,将其移入生根培养基上诱导生根。目前共获得2株已生根山金柑抗性植株,其中1株经PCR鉴定为阳性,有100余株山金柑还在生根培养基中。