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片形吸虫病是由片形吸虫所引起的一种危害牛羊等反刍动物和人的食源性人兽共患寄生虫病。片形吸虫隶属于复殖目(Digenea)片形科(Fasciolidae)的片形属(Fasciola)，呈世界性广泛分布，患病动物常因急、慢性肝、胆管炎并发全身性中毒以及营养障碍，导致生长发育受阻、生产性能下降、畜产品产量和质量下降、死亡率增高，每年在全球畜牧业生产中该病造成约20亿美元的经济损失。人也可以感染片形吸虫，主要是因为摄食了被片形吸虫囊蚴所污染的植物和水，全世界60多个国家的200多万人被感染，更多的人受到感染威胁。
肝片吸虫和大片吸虫是片形属常见的两个种，温带地区以肝片吸虫为主，热带和亚热带地区则以大片吸虫为主。温带地区还存在介于肝片吸虫和大片吸虫之间的“中间型”虫体。片形吸虫的分类主要基于传统的形态学特征，但是虫种之间形态极其相似，而且种内个体差异也较大，同一虫种又因宿主的种类的不同而可能导致虫体的形态不规则。由此可见，研究片形吸虫的分类和遗传变异，对片形吸虫病的防控具有重要意义。
本论文分为4个部分，分别研究了片形吸虫核糖体DNA序列的多态性、片形吸虫分子鉴定及检测方法的建立及应用、片形吸虫线粒体基因组序列分析及多态性研究、片形吸虫microRNAs So1exa深度测序与分析。
本研究的第一部分对来自不同流行区、不同宿主的片形吸虫的核糖体内转录间隔区(ITS)和基因间隔区(IGS)进行了研究。第一章第一节对来自中国、尼日尔、法国、美国、西班牙不同宿主的片形吸虫样品的ITS-1、5.8S和ITS-2 rDNA进行了PCR扩增及序列分析，并与GenBankTM公布的肝片吸虫、大片吸虫和“中间型”片形吸虫相应序列进行了比较。结果发现，肝片吸虫的序列长度为946 bp，大片吸虫和“中间型”的序列长度为945 bp，其中ITS-1序列为422bp，5.8S序列为162 bp；肝片吸虫ITS-2序列为362 bp，大片吸虫和“中间型”ITS-2序列为361 bp。不同来源肝片吸虫样品之间ITS-1序列的相似性为99.0％-100%，ITS-2序列的相似性为99.5%-100%，5.8S rDNA序列则完全一致。不同来源大片吸虫样品之间ITS-1序列的相似性为99.8%-100%，ITS-2的相似性为99.3%-100%，5.8S rDNA序列完全一致。“中间型”片形吸虫的ITS-1序列的相似性为100%，ITS-2的相似性为99.9%-100%，5.8S rDNA序列完全一致。肝片吸虫和大片吸虫之间在ITS的种间差异为1.0-1.6%，肝片吸虫和“中间型”之间的种间差异为0.9-1.1%，大片吸虫和“中间型”之间的种间差异为0.6-0.7%。本项研究结果为片形吸虫的分类学、遗传学及分子检测技术的建立等方面的进一步研究奠定了基础。
IGS序列在系统发育研究中具有明显的优势，它是核基因组拷贝序列中进化速率最快的序列，使得该序列在低水平分类阶元的系统发育、遗传变异以及进化研究中起到重要作用。本论文第一章第二节首次报道了肝片吸虫、大片吸虫和“中间型”片形吸虫的IGS序列。序列分析表明，肝片吸虫种内IGS序列相似性为97.4-100%，大片吸虫种内相似性为98.0-99.2%，“中间型”片形吸虫种内相似性为100%。肝片吸虫和大片吸虫种间在IGS rDNA差异为12.1-14.1%，肝片吸虫和“中间型”种间差异为22.9-25.3%，大片吸虫和“中间型”种间差异为16.7-18.3%，可见种内变异较小，而种间差异很大，且在此段rDNA中，来自中国黑龙江的“中间型”与肝片吸虫的差异更为明显。
将3种片形吸虫的IGS序列进行比较发现，“中间型”的第1-198位碱基与肝片吸虫和大片吸虫差异很大，第199-300处碱基的序列与大片吸虫对应序列完全相同，第304-307位、第338-349位、第988-1001位这3处，“中间型”具有其特有的序列。结果进一步表明“中间型”片形吸虫很有可能是一个独立的种，且我国黑龙江地区流行的“中间型”与大片吸虫更为相似。大片吸虫IGS的特有区域主要分布在第187-209位；在第218-268、第272-300、第342-356、第386-396、第402-413处与肝片吸虫有较大变异。肝片吸虫所特有但大片吸虫和“中间型”缺失的特征序列主要分布在第400-479、第535-559、第560-621处。该结果为片形吸虫种类的准确鉴定提供了又一新的遗传标记。
本论文的第二部分建立了两种分子生物学技术用于片形吸虫的分类、鉴定、检测。第二章第一节建立了片形吸虫的特异PCR检测方法。以核糖体rDNA内转录间隔区-2(ITS-2)作为遗传标记，根据肝片吸虫和大片吸虫在此区间上基因的差异，分别设计了两对特异引物，对来自中国、尼日尔、法国、美国、西班牙不同流行地区的肝片吸虫、大片吸虫和“中间型”片形吸虫进行了特异PCR的分子鉴定。该方法不仅可用于鉴定片形吸虫成虫的种类，还可对虫卵和中间宿主螺内的尾蚴进行检测和分类鉴定，为片形吸虫的分子检测、鉴别诊断及流行病学调查奠定了基础。
第二章第二节建立了片形吸虫环介导等温(LAMP)检测方法。根据肝片吸虫和大片吸虫核糖体rDNA IGS序列，分别设计了4条特异引物和2条环引物来检测片形吸虫感染，并能区分肝片吸虫和大片吸虫。以上两种检测方法的建立为片形吸虫的分子分类及检测提供了新的方法，也为人和动物片形吸虫病的分子诊断提供了手段。
本研究的第三部分对片形吸虫的线粒体cox1、nad1、nad4和nad5基因的序列变异及种群遗传结构，以及肝片吸虫、大片吸虫和“中间型”片形吸虫线粒体全基因组序列进行了研究。在cox1的研究中，肝片吸虫种内差异为0.0-1.1%，大片吸虫种内差异为0.0-1.8%，“中间型”种内差异为0.0-0.9%。肝片吸虫和大片吸虫的种间差异为2.1-2.7%，肝片吸虫和“中间型”的种间差异为1.3-1.5%，大片吸虫和“中间型”的种间差异为0.9-1.1%。在nad1的研究中，肝片吸虫种内差异为0.0-1.8%，大片吸虫种内差异为0.0-2.1%，“中间型”种内差异为0.0-0.5%。肝片吸虫和大片吸虫的种间差异为2.8-3.0%，肝片吸虫和“中间型”的种间差异为1.2-2.2%，大片吸虫和“中间型”的种间的差异为1.5-1.9%。在nad4的研究中，肝片吸虫种内差异为0.0-2.7%，大片吸虫种内差异为0.0-2.5%，“中间型”种内差异为0.0-0.2%。肝片吸虫和大片吸虫的种间差异为3.1-3.3%，肝片吸虫和“中间型”的种间差异为2.1-2.9%，大片吸虫和“中间型”的种间的差异为1.4-1.8%。在nad5的研究中，肝片吸虫种内差异为0.0-3.3%，大片吸虫种内差异为0.0-4.2%，“中间型”种内差异为0.0-1.1%。肝片吸虫和大片吸虫的种间差异为4.2-4.8%，肝片吸虫和“中间型”的种间差异为3.1-3.4%，大片吸虫和“中间型”的种间的差异为2.2-2.4%。nad5基因变异最大，nad4基因次之，而cox1和nad1基因变异较小，是相对比较保守的。
通过对线粒体cox1、nad1、nad4和nad5基因序列的多态性分析，显示这些基因序列可作为片形吸虫种特异的遗传标记。研究结果表明线粒体nad5基因进化较快.存在的种间遗传标记位点最多。本论文以3种构树方法进行的系统发育重建显示3个种群：所有的肝片吸虫位于一支，所有的大片吸虫聚为一支，“中间型”片形吸虫聚为一支，均有较高的bootstrap value(＞50%)。有趣的是，中国和尼日尔的大片吸虫分别聚在一起，显示出地域特征。但是，来自不同地区的肝片吸虫虫株则没有显示明显的地域特征。来自中国黑龙江地区的“中间型”样本与大片吸虫聚成一个大的分支，表明来自黑龙江的样本在线粒体基因上与大片吸虫更为相似，这与前面rDNA序列分析的结果一致。
本研究的第三部分第二节对3种片形吸虫的线粒体基因组全序列进行了测序及分析。在分析4个小片段的基础上，以长PCR方法分4个有重叠序列的片段，扩增出3种片形吸虫线粒体全基因组，PCR产物经克隆转化和测序，获得其线粒体基因组全序列并对其特点、结构及与其它吸虫的进化关系进行分析。来自中国及尼日尔的肝片吸虫线粒体全基因组的长度分别为为14462 bp及14460 bp，来自中国及尼日尔的大片形吸虫虫株的线粒体基因组长度均为14537 bp，“中间型”片形吸虫虫株的长度为14516 bp。3种片形吸虫线粒体全基因组包括12个蛋白编码基因、2个rRNA基因和22个tRNA基因，和其他吸虫一样缺乏atp8基因。所有3个虫种线粒体基因组内各基因的排列方式均为cox3、cytb、nad4L、nad4、atp6、nad2、nad1、nad3、cox1、rrnL、rrnS、cox2、nad6、nad5、AT区。在大片吸虫线粒体基因组的蛋白质基因中，cytb、cox1、cox2、cox3、nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L和atp6与GenBankTM报道的肝片吸虫对应基因长度相同，但nad5多3个碱基，nad6多6个碱基。在“中间型”片形吸虫线粒体基因组的蛋白质基因中，cytB、cox1、cox2、cox3、nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L、atp6和nad5与GenBankTM报道的肝片吸虫对应基因长度相同，但nad6多3个碱基。本研究中，来自中国的肝片吸虫线粒体基因全长与GenBankTM报道的肝片吸虫的线粒体基因全长相同，但来自尼日尔的肝片吸虫线粒体基因全长少2个碱基(位于AT富集区内)。
以猪蛔虫为外群，对7种吸虫线粒体基因组全序列进行分析，用NJ、MP和ML3种方法进行系统发育重建，结果显示形成2个大的进化支，一支中包括后睾科的华支睾吸虫(Cs)和猫后睾吸虫(Of)；在另一大支中，3种片形吸虫形成一个支系，包括中国肝片吸虫、尼日尔肝片吸虫、中国大片吸虫、尼日尔大片吸虫和“中间型”片形吸虫形成一个大的支系。在这一大支中，来自中国、尼日尔和澳大利亚的肝片吸虫聚在一小支；来自中国和尼日尔的大片吸虫聚在一起，并再同“中间型”片形吸虫相聚。片形吸虫的一支与卫氏并殖吸虫(Pw)相聚后又与分体科的日本血吸虫(Sj)相聚。这些结果揭示了线粒体基因序列在片形吸虫种群遗传结构研究中的有效性，对于片形吸虫种群生物学和遗传结构研究具有重要意义。
本研究的第四部分通过Solexa深度测序，对肝片吸虫和大片吸虫microRNA的表达谱进行了研究。测序获得了16824970(肝片吸虫)和11671341(大片吸虫)高质量reads，并与日本血吸虫的基因组进行比对，得到未注释的microRNAs在肝片吸虫和大片吸虫中的数量和百分比分别为1929896(72.68%)和8155965(78.76%)。通过新microRNAs预测，从肝片吸虫和大片吸虫各获得3个新microRNAs。通过差异分析，有23种microRNAs在两种片吸虫中均有表达。在大片吸虫中表达量最为丰富的microRNAs为bantam，为肝片吸虫该microRNA表达量的3.24倍。miR-71b-5p、miR-71、let-7的表达量也相当高。在肝片吸虫中表达量最为丰富的microRNA为miR-71，其次为bantam。在候选microRNAs各位点碱基偏向性的分析中，U在两种片形吸虫中均为最常使用碱基。
综上所述，本论文首次测定了3种片形吸虫的IGS rDNA序列，较为系统地研究了片形吸虫IGS及ITS rDNA序列的多态性，首次建立了区分3种片形吸虫的特异PCR及LAMP分子鉴定及检测方法，首次测定了3种片形吸虫线粒体基因组全序列，首次研究了肝片吸虫及大片吸虫microRNA表达谱的差异。这些研究结果不仅具有重要学术价值，而且也为有效防控片形吸虫病提供了技术手段及参考资料。