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半纤维素是自然界仅次于纤维素的可再生物生资源,未被充分开发利用,多数仍属于农业/工业副产物。例如,棕榈粕是棕榈油工业的农业副产物,盛产于东南亚地区,年产量约992万吨,甘露聚糖是其主要成分之一,约占干重的40%。甘露聚糖酶是甘露聚糖降解过程的关键酶。国家发展和改革委员会发布2016年新修订的《战略性新兴产业重点产品和服务指导目录》中,甘露聚糖酶是重点研发产品之一。综上所述,本研究挖掘新型低温耐盐甘露聚糖酶,并对低温甘露聚糖酶进行分子改造和低温耐盐甘露聚糖酶的应用潜能进行研究,以期达到经济效益、节能减排和环境保护等多方面的共赢。1、新型低温酶资源挖掘及分子改造GH26家族甘露聚糖酶ManAGN25来源于云南高寒湿地分离菌株Sphingobacterium sp.GN25。实验前,基于结构的分子功能预测策略,推测ManAGN25是一个具有低温活性甘露聚糖酶,原因如下:（1）与功能验证的蛋白序列进行比对,ManAGN25与Sphingomonas sp.JB13来源的低温甘露聚糖酶ManAJB13具有最高的一致性;（2）相比中高温甘露聚糖酶的一级结构,ManAGN25和ManAJB13催化位点附近的四个区域氨基酸残基数目均不同程度地增多;（3）相比中高温甘露聚糖酶的高级结构,ManAGN25和ManAJB13在催化区域附近均有增长的无规则卷曲,且整个蛋白的总可及表面积和总结构容积均增大。基于以上分析,对ManAGN25进行Escherichia coli BL21（DE3）异源表达和酶学性质研究。实验结果表明,纯化后的rManAGN25确实是一个低温甘露聚糖酶。该酶最适温度为35-40℃,其中30、20和10℃的酶活力分别为最大酶活力的78.2、44.8和15.0%;在37℃的半衰期仅为60min;在35℃和pH 7.0下,以角豆胶为底物的Km、Vmax和kcat分别为4.2 mg/mL,0.6μmol/min/mg和0.4/s;酶解角豆胶的Ea值为36.0 kJ/mol。GH26家族甘露聚糖酶ManAJB13来源于个旧磷矿土分离菌株Sphingomonas sp.JB13,本实验室研究表明该酶是一个低温甘露聚糖酶,且低温活性高于ManAGN25和Man5HJ14。为了增强其应用潜能,同时揭示影响甘露聚糖酶低温特性的分子特征,本研究对ManAJB13热稳定性进行分子改性。根据固有无序化蛋白区域预测（IUPred,基于多肽链形成稳定结合能力计算方法）,设计删除N端冗余序列的突变体DeP41和DeP41P42,结果降低了无序趋势;另外,通过折叠辨识模拟方法构建野生酶ManAJB13和突变体高级结构,结构对比分析表明突变体的结构刚性强于野生酶。结合能量学和高级结构分析结果,预示突变体热活性增高和/或热稳定性强。为了避免冗余N端对实验结果影响,本研究通过HRV 3C蛋白酶切除了表达载体引入的N端序列。实验结果显示突变体rDeP41N和rDeP41P42N的热活性和热稳定性均得到了提高,与预期结果相符:在热活性方面,突变体rDeP41N和rDeP41P42N的最适温度分别为40和45℃,比野生酶rManAJB13N的最适温度（35℃）高出5-10℃;在热稳定性方面,突变体rDeP41N和rDeP41P42N在50℃的半衰期与野生酶rManAJB13N相比分别提高了2倍和4倍。2、新型耐盐酶资源挖掘及其在洗涤工业中的应用潜力GH5家族甘露聚糖酶Man5HJ14来源于黑井古镇盐矿土分离菌株Bacillus sp.HJ14,在E.coli BL21（DE3）中表达。纯化的rMan5HJ14最适pH和最适温度分别为pH 6.5和65℃,在低温下具有催化活性。该酶表现出较好的耐盐性:经3.0-30.0%（w/v）NaCl处理60 min,酶活力几乎没有损失;在反应体系中添加3.0-30.0%（w/v）NaCl,活性保持在56%以上;添加表面活性剂和螯合剂（SDS、CTAB、EDTA和三聚磷酸钠）对酶活力几乎没有影响（保持>82.4%的酶活力）。液体洗涤剂（特百惠、威露士、蓝月亮、汰渍和奥妙）在0.52.0%（v/v）浓度范围内对酶活性的影响不大（保持>72.4%酶活力）。rMan5HJ14在各种洗衣液中的酶活力和稳定性明显优于商业β-甘露聚糖酶（南箭）。以上结果表明该酶在洗涤工业中具有应用潜力。此外,该酶酸性氨基酸残基（D和E）含量高,占11.97%,可能与该酶具有较好的SDS和NaCl耐受性有关。3、甘露寡糖的酶法制备及其益生潜力利用GH26家族rManAJB13和GH5家族rMan5HJ14降解角豆胶和棕榈粕,对降解产物进行薄层色谱（TLC）和电喷雾电离质谱（ESI）比较分析。结果表明:rManAJB13和rMan5HJ14降解棕榈粕产物没有明显差异,产物均为甘露糖到甘露四糖;但两者降解角豆胶产物有明显差异,rMan5HJ14降解角豆胶可得到甘露七糖,而与之相比,rManAJB13降解角豆胶得到甘露六糖,同时得到更高浓度的甘露三糖和四糖。酶解产物可有效促进Lactobacillus.plantarum CICC 24202的增殖。本论文对云南3种特殊生境来源微生物的甘露聚糖酶进行研究,（1）揭示GH26家族甘露聚糖酶ManAGN25的新型低温活性及其分子适应特征。基于相关适应特征,对GH26家族甘露聚糖酶ManAJB13的温度特性进行理性设计,成功获得热活性和热稳定性改良的低温甘露聚糖酶;（2）揭示了GH5家族甘露聚糖酶Man5HJ14的新型耐盐特性;（3）揭示了ManAJB13和Man5HJ14在甘露寡糖酶法制备及洗涤工业中的应用潜能。本研究为新型低温耐盐甘露聚糖酶的开发和应用奠定基础,同时为低温甘露聚糖酶的分子改造提供理论指导。