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类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以对称性多关节炎为临床特征的慢性炎症性疾病。病理特征是关节滑膜的炎症和增生,伴骨、软骨的侵蚀。其发病机制尚不明确,表观遗传学可能是未来的研究方向。RA成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)作为滑膜炎的主要组成细胞,它的侵袭和抗凋亡特性,以及调节免疫反应和慢性炎症的能力,最终使它成为关节炎的主要参与者。了解RA-FLS的表观遗传特性可能有助于我们识别RA新的诊断和预后标志物以及治疗靶点。近年来,micro RNA(mi RNA)在RA-FLS中的功能研究成为RA机制研究的热点。我们前期研究发现mi R-146a在RA患者的成纤维样滑膜细胞中表达下调,这引起了我们的兴趣。mi R-146a在RA中到底扮演一个什么角色呢?是促炎基因还是抑炎基因呢?生物信息学预测和双荧光素酶报告基因都证实白介素-1受体相关激酶1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6)是mi R-146a的靶基因。TRAF6是c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)的上游分子,JNK信号通路与细胞增殖、凋亡、炎症反应关系密切。本研究拟以此为切入点,深入研究mi R-146a对RA-FLS生物学行为的影响,探索mi R-146a调控RA-FLS的分子机制。并在此基础上,从分子、细胞、动物模型水平来系统研究新型免疫调节剂艾拉莫德是否可以通过调节mi R-146a发挥抑制RA滑膜增殖、炎症反应的作用。第一部分Mi R-146a靶向IRAK1/TRAF6/JNK1信号通路对RA-FLS增殖、侵袭、迁移、凋亡和炎症反应的调控机制研究目的:明确mi R-146a在RA-FLS中的表达情况,研究mi R-146a对RA-FLS增殖、侵袭、迁移、凋亡及炎症反应的作用,探讨mi R-146a调控RA-FLS的分子机制。方法:(1)收集RA患者、创伤对照患者的滑膜,酶消化法提取人原代成纤维样滑膜细胞,并培养。(2)实时定量PCR(RT-q PCR)检测RA-FLS和Ctrl-FLS中mi R-146a的表达情况。(3)mi R-146a mimic质粒和inhibitor质粒及其相应的阴性对照转染RA-FLS。(4)RT-q PCR检测质粒转染后RA-FLS中mi R-146a的表达情况。(5)CCK-8法检测细胞活性,比较转染后RA-FLS增殖情况。(6)Transwell侵袭实验比较转染后RA-FLS的侵袭能力。(7)Wound healing细胞划痕实验比较转染后RA-FLS的迁移能力。(8)AV/PI流式细胞仪检测转染后RA-FLS细胞凋亡率。(9)收集FLS上清液,酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表达水平。(10)提取FLS总RNA及蛋白,分别用RT-q PCR和Western blot法检测靶基因及通路分子的m RNA和蛋白水平。结果:(1)RT-q PCR结果显示RA-FLS组mi R-146a水平明显低于Ctrl-FLS组。(2)与Mimic-NC组比较,过表达mi R-146a能明显抑制RA-FLS的增殖;与Inhibitor-NC组比较,抑制mi R-146a表达可促进RA-FLS的增殖。(3)Transwell侵袭实验结果显示,与Mimic-NC组比较,过表达mi R-146a能明显减少RA-FLS侵袭的细胞数;与Inhibitor-NC组比较,抑制mi R-146a表达能使RA-FLS侵袭的细胞数增多。(4)Wound healing细胞划痕实验显示,与Mimic-NC组比较,过表达mi R-146a能明显减低RA-FLS的迁移率;与Inhibitor-NC组比较,抑制mi R-146a表达可促进RA-FLS的迁移。(5)AV/PI流式细胞仪检测结果显示,与Mimic-NC组比较,过表达mi R-146a能明显增加RA-FLS细胞凋亡率;与Inhibitor-NC组比较,抑制mi R-146a表达能使RA-FLS细胞凋亡率下降。(6)ELISA法结果提示过表达mi R-146a可以抑制RA-FLS分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17,而抑制mi R-146a表达会促进RA-FLS分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17。(7)RT-q PCR、Western blot结果提示过表达mi R-146a能降低IRAK1、TRAF6 m RNA和IRAK1、TRAF6、p-JNK1蛋白水平。而抑制mi R-146a表达会升高IRAK1、TRAF6 m RNA和IRAK1、TRAF6、p-JNK1蛋白水平。结论:在RA-FLS中,mi R-146a表达下调,过表达mi R-146a能抑制RA-FLS的增殖、侵袭、迁移能力及炎症反应,促进RA-FLS凋亡。mi R-146a的这种作用机制可能与抑制IRAK1/TRAF6/JNK1信号通路有关。本研究揭示了mi R-146a对FLS细胞生物学行为的调控机制,为以后利用mi R-146a作为RA治疗靶点提供了坚实的理论基础。第二部分艾拉莫德(T-614)通过调控mi R-146a抑制RA-FLS功能的体外、体内研究目的:通过体外实验研究艾拉莫德(T-614)对RA-FLS中mi R-146a及其靶基因IRAK1、TRAF6的调控机制,阐明艾拉莫德对mi R-146a Inhibitor质粒转染后RA-FLS增殖、侵袭、迁移、凋亡和炎症反应的影响,验证艾拉莫德可以通过调节mi R-146a发挥抑制RA-FLS功能的作用。然后建立CIA大鼠模型,通过体内实验阐明艾拉莫德抑制RA滑膜增殖、炎症反应的作用与调控mi R-146a有关。方法:(1)CCK-8法检测艾拉莫德对RA-FLS活力的影响。(2)艾拉莫德干预RA-FLS后,RT-q PCR和Western blot法检测mi R-146a及靶基因通路的m RNA和蛋白水平。(3)艾拉莫德干预mi R-146a Inhibitor质粒转染后RA-FLS,RT-q PCR检测mi R-146a的表达。(4)CCK-8法检测细胞存活率,比较艾拉莫德干预质粒转染后RA-FLS的增殖情况。(5)Transwell侵袭实验比较艾拉莫德干预质粒转染后RA-FLS的侵袭能力。(6)艾拉莫德干预后,Wound healing细胞划痕实验比较质粒转染后RA-FLS的迁移能力。(7)AV/PI流式细胞仪检测艾拉莫德干预质粒转染后RA-FLS细胞凋亡率。(8)收集艾拉莫德干预质粒转染后FLS上清液,ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表达水平。(10)提取FLS总RNA及蛋白,分别用RT-q PCR和Western blot法检测靶基因及通路分子的m RNA和蛋白水平。(9)建立CIA大鼠模型,进行艾拉莫德、mi R-146a inhibitor质粒干预,采用关节炎评分评估CIA大鼠关节炎严重程度。(10)HE染色观察大鼠滑膜组织病理改变。(11)TUNEL染色检测大鼠滑膜细胞的凋亡情况。(12)分别用RT-q PCR法和免疫组化(IHC)检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表达情况。(13)分别用RT-q PCR法和IHC法检测大鼠滑膜组织中mi R-146a及靶基因通路的表达情况。结果:(1)20μg/m L、40μg/m L、80μg/m L、160μg/m L T-614干预RA-FLS,可显著抑制RA-FLS的细胞活力,明显上调RA-FLS中的mi R-146a水平,降低IRAK1、TRAF6的水平。且随着T-614的浓度增大,RA-FLS细胞活力抑制越明显;mi R-146a水平随之升高,IRAK1、TRAF6的水平也随着下降。确定20μg/m L T-614用于后续实验。(2)20μg/m L T-614干预mi R-146a Inhibitor质粒转染后RA-FLS,RT-q PCR结果显示,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS中mi R-146a表达量较Inhibitor-NC组明显下调;T614&inhibitor-NC组RA-FLS中mi R-146a表达量明显高于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(3)CCK-8检测结果显示,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS细胞增殖能力高于Inhibitor-NC组,并且在72h时具有显著差异;T614&inhibitor-NC组RA-FLS细胞增殖能力低于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组,并且在72h具有显著差异。(4)Transwell侵袭实验结果显示,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS侵袭细胞数目高于Inhibitor-NC组;T614&inhibitor-NC组RA-FLS侵袭数目明显少于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(5)Wound healing细胞划痕实验显示,与Inhibitor-NC组相比,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS愈合面积明显增大;T614&inhibitor-NC组RA-FLS愈合面积明显少于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(6)AV/PI流式细胞仪检测结果显示,与Inhibitor-NC组相比Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS凋亡比例明显降低;T614&inhibitor-NC组RA成纤维样滑膜细胞凋亡显著高于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(7)Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS上清液中TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-17含量高于Inhibitor-NC组;T614&inhibitor-NC组促炎因子水平低于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(8)RT-q PCR、Western blot结果显示,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS中IRAK1、TRAF6 m RNA和IRAK1、TRAF6、p-JNK1蛋白的表达水平高于Inhibitor-NC组;T614&inhibitor-NC组RA-FLS中IRAK1和TRAF6 m RNA和IRAK1、TRAF6、p-JNK1蛋白的表达水平低于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a。(9)Inhibitor-mi R-146a组CIA大鼠的关节炎评分高于Model组;T-614组CIA大鼠的关节炎评分低于Model组和T-614&inhibitor-mi R-146a组,而T-614&inhibitor-mi R-146a组的CIA大鼠关节炎评分低于inhibitor-mi R-146a组。(10)滑膜HE染色结果显示,Model组大鼠滑膜上皮增生,炎症细胞浸润明显。Inhibitor-mi R-146a组CIA大鼠滑膜增生、炎症细胞浸润程度高于Model组;T-614组CIA大鼠的滑膜增生和炎症细胞浸润程度低于Model组和T614&inhibitor-mi R-146a组,且T614&inhibitor-mi R-146a组CIA大鼠的滑膜增生和炎症细胞浸润程度低于Inhibitor-mi R-146a组。(11)滑膜TUNEL染色结果显示,Model组凋亡细胞百分比低于Control组;Inhibitor-mi R-146a组凋亡细胞百分比低于Model组;T614组凋亡细胞百分比高于Model组和T614&inhibitor-mi R-146a组;且T614&inhibitor-mi R-146a组凋亡细胞百分比高于Inhibitor-mi R-146a组。(12)RT-q PCR检测和IHC结果都显示,Model组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17表达高于Control组,低于Inhibitor-mi R-146a组;T-614组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17表达低于Model组和T614&inhibitor-mi R-146组;且T614&inhibitor-mi R-146a组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17表达低于Inhibitor-mi R-146a组。(13)RT-q PCR检测和IHC结果提示,Model组与Control组相比,mi R-146a表达量下降,而IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达升高;Inhibitor-mi R-146a组与Model组相比,mi R-146a表达量下降,IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达升高;与Model组和T614&inhibitor-mi R-146组相比,T-614组mi R-146a表达量升高,而IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达下降;且与Inhibitor-mi R-146a组相比,T614&inhibitor-mi R-146a组mi R-146a表达量升高,而IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达下降。结论:艾拉莫德能抑制RA-FLS细胞增殖、迁移、侵袭和炎症,促进其凋亡;同时上调RA-FLS中mi R-146a表达,降低IRAK1、TRAF6和p-JNK1的水平;抑制mi R-146a可以消弱艾拉莫德抑制RA-FLS细胞增殖、迁移、侵袭和炎症,促进其凋亡的作用。CIA大鼠中mi R-146a表达被抑制后,艾拉莫德对RA滑膜增殖和炎症的抑制作用减弱,同时IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达升高。艾拉莫德在体外、体内都能够通过上调mi R-146a,下调其靶基因IRAK1、TRAF6,发挥抑制RA-FLS增殖及炎症反应,促进其凋亡的作用。艾拉莫德对RA的治疗作用,部分是通过上调mi R-146a,下调IRAK1/TRAF6/JNK1信号通路实现的。