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牙髓是牙齿中唯一的软组织,位于由牙本质围成的牙髓腔内。牙髓组织在外界物理、化学或细菌等因素刺激下可发生炎症性损伤。牙髓炎症发生时牙髓组织中多种炎症因子、趋化因子聚集,同时各种免疫细胞被激活参与调控炎症反应。Hahn等研究表明,牙髓炎发生时牙髓组织中的淋巴细胞明显高于正常牙髓组织[1],包括巨噬细胞、树突状细胞和T淋巴细胞等,同时TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ和IL-8等炎症因子表达水平上调[2]。干扰素-γ(interferon,IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子。研究表明,IFN-γ在较浅的龋坏导致的早期慢性牙髓炎中占主导地位[3];当龋坏加深时,IFN-γ仍然存在于牙髓炎症反应中。IFN-γ与模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)配体协同作用可以促进人牙髓细胞分泌促炎因子CXCL10和IL-6[4]。Sonoda等通过体内实验研究发现IFN-γ可以修复不可逆性牙髓炎来源的DPSCs的牙本质形成能力[5]。还有研究表明,IFN-γ预刺激人牙髓干细胞,可以促进与其共培养的骨髓间充质干细胞的迁移能力[6]。以上研究结果表明,IFN-γ不仅在炎症反应中发挥重要促炎作用,在牙髓组织的损伤修复中也发挥不可或缺的作用。DPSCs(dental pulp stem cells,DPSCs)是位于牙髓组织中未分化的间充质干细胞,具有高度的自我更新能力和多向分化潜能,首次由Gronthos等从人的第三磨牙分离得出[7]。DPSCs在不同的诱导微环境中可以分化为成牙、成骨、成软骨、成脂肪、成神经等细胞[8]。DPSCs取材于正畸减数拔除的恒牙,取材方便,广泛用于组织损伤修复研究。有研究表明矿化液体外诱导DPSCs14天可以形成矿化结节,体内实验研究发现DPSCs可以形成类牙本质样结构[9]。在牙髓炎症的早期或者牙髓炎的可复性阶段,DPSCs增殖、迁移、分化为成牙本质细胞,在临近刺激的牙本质近髓侧形成修复性牙本质,抵御外界刺激。DPSCs的增殖、迁移和成牙/成骨向分化涉及了牙髓牙本质复合体抵御外来刺激的一个连续的细胞生命活动,三种生命活动缺一不可。本课题旨在构建较纯化的DPSCs细胞系,通过体内体外实验研究IFN-γ对人牙髓细胞增殖、迁移和成牙/成骨向分化能力的影响,并探讨IFN-γ影响人牙髓干细胞成牙/成骨向分化的分子机制,为牙髓组织的损伤修复提供新线索。主要研究成果如下:一、人牙髓干细胞系的成功建立我们选取18周岁以下年轻患者因正畸或阻生拔除的恒牙,取其新鲜牙髓组织,用组织块联合酶消化法获得原代培养的牙髓细胞。用有限稀释法挑选具有克隆形成能力的DPSCs,扩大培养。经流式细胞仪分析鉴定我们获得了表达间充质干细胞表面标志的DPSCs。矿化诱导液培养该细胞可以形成茜素红染色阳性的矿化结节;成脂诱导液培养该细胞可以形成油红O染色阳性的脂滴结构。以上实验结果表明我们获得了较纯化的人牙髓干细胞系。二、IFN-γ可以促进人牙髓干细胞的增殖能力我们用含IFN-γ0、0.05、0.5、5、50和500 ng/m L的培养液刺激人牙髓干细胞,用MTT实验和Ed U实验分别检测DPSCs的增殖活力。结果显示,IFN-γ0.05、0.5和5ng/m L组均上调了DPSCs的增殖活力。同时用RT-PCR检测DPSCs细胞周期相关蛋白的表达水平。RT-PCR结果显示实验组PCNA、cyclin B1、cyclin D1的表达上调,P21表达水平下调。即体外实验研究表明IFN-γ可以促进人牙髓干细胞的增殖能力。三、IFN-γ可以促进人牙髓干细胞的迁移能力我们用不同浓度的IFN-γ刺激人牙髓干细胞,用Transwell和划痕实验检测IFN-γ对人牙髓干细胞迁移能力的影响。Transwell实验结果显示IFN-γ组迁移的细胞数目明显高于对照组。划痕实验结果类似Transwell实验结果。即体外实验研究表明IFN-γ促进了人牙髓干细胞的迁移能力。四、IFN-γ抑制人牙髓干细胞的成牙/成骨向分化,NF-κB和MAPK信号通路可能参与其中我们首先用含不同浓度IFN-γ的矿化液在体外诱导人牙髓干细胞两周,做茜素红染色实验检测其矿化结节形成能力。实验结果显示IFN-γ抑制了人牙髓干细胞的矿化结节形成能力。在矿化诱导液中加入信号通路抑制剂(PDTC、SB203580、U0126或SP600125),同时加或不加IFN-γ,做茜素红染色和Western Blot实验,检测DPSCs的成牙/成骨向分化能力。实验结果显示,PDTC和SB203580组DPSCs矿化结节形成能力和成骨相关蛋白表达水平均明显高于IFN-γ组。这一实验结果提示我们IFN-γ可能通过NF-κB和MAPK信号通路抑制了DPSCs的成牙/成骨向分化能力。然后,我们检测了NF-κB和MAPK信号通路中信号蛋白的磷酸化水平变化。Western Blot实验结果显示P65的磷酸化水平随IFN-γ刺激时间延长逐渐被上调,PDTC的加入下调了P65的磷酸化水平;P38的磷酸化水平被下调,当加入通路抑制剂SB203580后,该磷酸化水平被上调。以上实验结果提示我们,IFN-γ可能通过激活P65,抑制P38的磷酸化水平,介导其对DPSCs成牙/成骨向分化的抑制作用。其次,我们将人牙髓干细胞与仿生多孔纳米纤维凝胶支架材料复合,用含或不含IFN-γ及通路抑制剂的矿化诱导液体外预培养1周,无菌条件下移植到裸鼠皮下。Micro-CT实验结果显示,IFN-γ抑制了矿化组织的形成,而抑制剂组逆转了这一效果。HE染色显示,所有组别均有类牙髓样软组织形成,并充满于支架材料的孔隙中。Masson染色和Van Gieson染色实验结果显示,IFN-γ组形成的类牙本质样组织明显低于对照组,且当加入NF-κB通路抑制剂PDTC或者MAPK/P38的抑制剂SB203580后,明显促进了DPSCs的类牙本质样组织形成能力。这一实验结果与体外实验研究结果相一致,进一步提示我们IFN-γ可能通过NF-κB/P65和MAPK/P38信号通路抑制人牙髓干细胞的成牙/成骨向分化能力。综上所述,我们通过体内外实验共同研究了IFN-γ对人牙髓干细胞增殖、迁移和成牙/成骨向分化能力的影响,并探索了可能涉及的信号通路。