论文部分内容阅读
目的：EPC已经成功地从骨髓和外周血中得到分离。近年来研究表明EPC可作为内皮损伤修复的另一个细胞来源，EPC在人和动物模型已经显示能促进血管新生和再内皮化，表明它在维持内皮完整性中有重要作用。然而EPC促进血管新生的机制仍不清楚，可能与EPC直接参与新血管生成和分泌一些成血管的细胞因子促进新血管生成有关。糖尿病通常受到心血管并发症的困扰，包括外周血管疾病。在有外周血管疾病的患者，侧支循环形成不能代偿由于动脉闭塞而导致的血流减少，这个问题在侧支循环形成低下的糖尿病患者更是如此，这将导致严重的肢体缺血性疼痛甚至截肢。由于EPC功能失调可能降低糖尿病患者的血管再生能力，因此有学者提出糖尿病的血管并发症源于EPC功能失调的假说。认为血管内皮功能失调在糖尿病血管并发症中有重要的作用。EPC虽然具有强大的增殖和分化成内皮细胞的能力，但是糖尿病外周血EPC在增殖、黏附、迁移和血管结构的参与能力上均缺陷。而EPC在糖尿病骨髓中的变化目前研究较少，是否也存在功能受损有待于进一步研究。因此，本实验推测糖尿病骨髓EPC数量和生物学活性也受到影响，并同时比较骨髓和外周血EPC的数量和生物学活性的差异。这对进一步明确糖尿病血管并发症的发病机理有重要作用，并可能为糖尿病并发症早期诊断、治疗和判断预后提供线索。为了证实我们的推测，设计了本实验。
方法：
1．糖尿病动物模型的建立：雄性SD大鼠35只，试验组25只，按50 mg/kg一次性腹腔快速注射1％的STZ液。对照组10只，注射等量的柠檬酸钠．柠檬酸缓冲液。注射14d后动物血糖浓度>16.65 mmol/L判定为1型糖尿病动物模型，取注射后14天的动物实验。
2．外周血和骨髓EPC的分离、培养和鉴定：分别取大鼠外周血和骨髓，加PBS等倍稀释并混匀。沿管壁缓慢加入装有大鼠淋巴细胞分离液(1.083g/ml)的15ml离心管中。2000r/minx20min密度梯度离心后将中间的白雾层吸出并置入另一短中管中，加入5倍体积的M199，以1500 r/min离心5 min，洗涤细胞两次。末次离心后，弃上清，加入M199重悬细胞。以1×106/mL的密度接种于预涂胶原的培养板中，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。3-4d后换液，将未贴壁细胞弃之。在倒置相差显微镜下连续观察体外培养的EPC的形态、生长及增殖情况。胰酶消化培养7天的贴壁细胞试验。用免疫组织化学和免疫荧光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1检测来鉴定EPC。
3．EPC体外功能的测定：收集培养七天的贴壁细胞作EPC黏附能力测定；用改良的Boyden小室作EPC迁移能力测定；MTT法测定EPC增殖能力；用体外血管生成试剂盒作EPC体外血管生成能力的测定；用放射性免疫法测定细胞的培养液GM-CSF，EPO和IL-8的含量。
结果：
1．骨髓和外周血来源的EPC在体外培养时都呈梭形，贴壁生长，二者均表达CD34，CD133和VEGFR-2表达，且能结合UEA-Ⅰ并摄取ac-LDL，证明所培养细胞为EPC。
2．EPC数量测定发现糖尿病组骨髓和外周血的EPC数目比对照组明显减少，并且对照组和糖尿病组大鼠外周血EPC数目都比骨髓EPC数目减少。
3．EPC体外功能测定表明糖尿病组大鼠外周血和骨髓EPC的黏附能力比对照组明显减少；迁移能力降低：增殖能力减弱；体外血管生成能力降低；EPC分泌的IL-8，EPO和GM-CSF比对照组都减少。
4．大鼠外周血EPC迁移能力比骨髓EPC减弱；增殖能力降低；EPC分泌的IL-8和EPO也减少。而外周血EPC和骨髓EPC的黏附数目，体外血管生成能力和EPC分泌的GM-CSF没有差别。
结论：
1．糖尿病大鼠外周血和骨髓EPC的数目减少，并且生物学活性降低，主要表现在黏附能力明显减弱；迁移能力降低；增殖能力减弱；体外血管生成能力降低和EPC分泌的功能减少。
2．大鼠外周血EPC比骨髓EPC数量减少；迁移能力，增殖能力降低；EPC分泌的IL-8和EPO也减少。