【摘 要】
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目的克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1基因编码B细胞表位抗原优势序列并构建重组表达载体，实现原核高效表达，进而研究表达蛋白的抗原性，为研究其致病机制及菌
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目的克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1基因编码B细胞表位抗原优势序列并构建重组表达载体，实现原核高效表达，进而研究表达蛋白的抗原性，为研究其致病机制及菌毛抗原蛋白的研发提供实验基础和理论依据。 方法根据GenBank公布的牛源无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1基因序列设计与合成引物，以牛乳源性无乳链球菌基因组DNA为模板，利用PCR技术获得AP1抗原表位序列基因片段，经克隆与序列分析正确后，将其亚克隆至原核表达载体pET-30(a)中，构建重组质粒pET-30a-AP1，将其转化到E.coli/BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE电泳，Bandscan软件分析表达蛋白图谱，利用Western-blot试验验证重组蛋白的反应原性。利用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白，经弗氏佐剂乳化后免疫家兔，探索其免疫原性，并建立检测免疫抗体滴度的间接ELISA。制备无乳链球菌原生质体，经间接荧光抗体检测方法验证表达蛋白AP1为菌体表面蛋白，以进一步证明实验结果的可靠性和科学性。 结果经测序和酶切结果表明，成功克隆了奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1编码的B细胞表位抗原序列，并成功构建了原核表达重组质粒，实现原核高效表达，菌体裂解上清中可溶性蛋白含量达到48.5％，重组蛋白的相对分子质量为34ku，纯化蛋白含量达到3.75mg/mL。Western-blot结果表明，重组蛋白具有良好的反应原性，间接ELISA检测免疫抗体滴度结果表明，表达蛋白具有良好的免疫原性，三免后56d的免疫抗体滴度达到1∶4200，70d之后依然保持较高抗体滴度。间接荧光抗体检测原生质体膜蛋白结果显示，AP1蛋白为镶嵌于细胞膜表面的抗原组分。 结论成功克隆牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1抗原B细胞表位序列，序列含有714bp，编码238个氨基酸残基;构建的原核重组表达载体pET-30a-AP1在大肠杆菌中得到高效可溶性表达;PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1抗原具有良好的抗原性，可以作为进一步研究的候选抗原;建立了检测免疫抗体的间接ELISA;无乳链球菌表面蛋白AP1为菌体膜表面蛋白，可以作为进一步研究其感染机制研究的靶标分子。
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