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黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的土传性维管束病害。在我国,黄萎病已经成为棉花生产的主要障碍。棉花黄萎病难以防治,主要原因是其病原菌致病机理复杂,因此,鉴定大丽轮枝菌致病相关基因,阐明其致病机理已成为当前研究热点。农杆菌介导的遗传转化法在功能基因组学中发挥着重要作用,是分离鉴定新基因的有效方法。本实验室前期通过农杆菌介导的遗传转化法获得了高致病力大丽轮枝菌Vd991的T-DNA随机插入突变体15131个。传统温室黄萎病菌致病性鉴定方法已经用于大丽轮枝菌致病相关突变体的筛选,但效率偏低,远不能满足致病相关突变体的筛选与鉴定研究。因此,建立快速、高通量致病性鉴定方法对于大丽轮枝菌致病相关突变体的筛选至关重要。本研究首先明确了引起棉花黄萎病症状的孢子浓度为大于5.0×105个孢子/mL;建立了大丽轮枝菌的标准化培养方法,简化了孢子悬浮液制备过程;优化了单孢分离、扩大培养、孢子悬浮液制备、接种、继续培养和结果统计等环节,建立了大丽轮枝菌致病性快速鉴定流程,进一步统筹设计构建了大丽轮枝菌致病相关突变体快速筛选体系。运用构建的快速筛选体系对1344个T-DNA插入突变体进行筛选,结果发现:（1）69个突变体致病力明显下降,16个突变体致病力显著下降或丧失;（2）通过传统菌液蘸根法群体验证出6个突变体对军棉1号致病力均明显下降;（3）通过Dps统计软件分析病情指数,发现两个致病力几乎丧失的突变体M01C06和M01E10。利用hiTAIL-PCR方法扩增到突变体M01A06、M01C06、M03B07和M04H05插入位点右侧序列。通过测序和BLAST分析,发现突变体M01C06的T-DNA插入点位于第四条染色体上基因VDAG05889和VDAG05890之间。VDAG05889编码蛋白预测为翻译起始因子5,VDAG05890编码蛋白预测为细胞色素P450 3A13,分别命名为VdIF5和VdCYP1。通过定量PCR方法分析VdIF5和VdCYP1基因的表达水平,VdCYP1基因表达量显著下降,推测出了影响M01C06致病力的基因为VdCYP1。利用农杆菌介导的遗传转化法获得了VdCYP1基因缺失突变体,经过产孢量检测、表型鉴定和致病力测定,发现（1）?VdCYP1缺失突变体和突变体M01C06生长速率及生长表型无变化;（2）?VdCYP1缺失突变体和突变体M01C06产孢能力和致病力显著下降。证明了突变体M01C06致病力的下降是由于T-DNA插入影响了VdCYP1基因的表达,VdCYP1是大丽轮枝菌致病相关基因。克隆了VdCYP1基因全长序列,基因组序列长1767bp,cDNA序列长1458bp,编码氨基酸485个,5个外显子,4个内含子。通过SMART和TMHMM2.0软件预测分析发现VdCYP1基因含有跨膜结构和细胞色素P450保守结构域,预测该基因功能主要与真菌次级代谢物合成及致病力相关。定量PCR分析表明大丽轮枝菌侵染棉花组织过程中VdCYP1接种后1-3天内被显著诱导表达,表明VdCYP1基因与大丽轮枝菌侵染过程初期密切相关。构建了Vd CYP1过表达载体,并利用农杆菌介导的遗传转化法导入到突变体M01C06和缺失突变体?VdCYP1中,构建了突变体M01C06的过表达菌株和突变体?VdCYP1的功能互补转化子。致病力鉴定表明,过表达菌株和功能互补转化子致病力显著提高,病情指数分别达到60.11±1.94和62.49±3.13,与野生型菌株致病力（病情指数为68.05±3.62）相似,初步证明了细胞色素P450基因参与大丽轮枝菌侵染的致病功能。