论文部分内容阅读
目的:百草枯(paraquat,PQ),是目前世界范围内使用广泛的有机杂环类接触性除草剂,随着其在我国农业上的广泛应用,PQ中毒也日趋增多。PQ对人畜均有较强毒性,经皮肤接触、呼吸道及消化道进入体內，造成急性中毒卸局?死剂量小,病程进展快,且尚缺乏特效解毒剂及有效降低毒物毒性的治疗手段,临床上病死率高。PQ以原形的形式主要经肾脏排泄,这也是导致肾脏损伤的主要原因。目前PQ经肾脏排泄的确切机制及PQ中毒致肾组织损伤机制均尚不完全明确。本研究通过观察PQ染毒大鼠肾组织病理变化,测定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的变化,肾组织匀浆丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活力,并应用免疫组织化学方法观察肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)与转化生长因子-β1 (Transforming growth factor-β1,TGF-β1)在PQ中毒大鼠肾组织中的表达及相互作用,以及促肝细胞生长素(Hepatocyte Growth-promoting Factors,pHGF)对上述指标的干预影响,进一步探讨PQ中毒致肾损伤的机制及促肝细胞生长素对PQ中毒大鼠肾损伤的预防及治疗作用。方法:选择健康成年SD (Sprague-Dawley)大鼠108只,随机分为三组:①对照组(A组)36只;②染毒组(B组)36只;③pHGF治疗组(C组)36只。B、C组一次性给予25mg/kgPQ腹腔注射染毒,A组给予等量的生理盐水腹腔内注射,之后,C组立即给予pHGF1mg/kg腹腔注射,每12h一次,最长用药时间为14天,B组给予与C组等量生理盐水腹腔注射。A、B、C组分别于染毒后1d、3d、5d、7d、10d、14d各取6只大鼠,乙醚麻醉后腹主动脉取血处死,血液离心后取血清备测定血清BUN、Cr含量;而后迅速留取左肾上极组织,制成10%肾组织匀浆测定MDA含量、SOD及GSH-Px活力,其余肾组织用10%甲醛固定,HE染色观察病理学改变及免疫组织化学法观察HGF及TGF-β1在中毒大鼠肾组织中的表达。结果1.大鼠中毒表现:大鼠于染毒后30min~2h即可出现中毒表现,B组主要表现为:倦怠、嗜睡、烦躁、进食水明显减少;呼吸急促、张口呼吸、口周紫绀;血尿、少尿或无尿;走路不稳、肢体无力、头颤;松毛、眼鼻血性分泌物等;C组经pHGF治疗后中毒表现较B组减轻,呼吸困难明显改善,血尿情况改善,少尿、无尿时间均明显缩短。2. PQ中毒大鼠肾组织形态学变化(1)大体标本A组:正常大鼠肾脏外观不肿,色泽正常;B组:染毒大鼠肾脏外观肿胀,被膜紧张,颜色深呈紫黑色,表面有散在出血点;C组:pHGF干预后大鼠肾脏外观肿胀减轻,色泽红,表面无明显出血点。(2)HE染色A组(Fig.4):肾脏各部分结构在各时间点均无明显病理变化;B组(Fig.5-9):①肾小球:改变相对轻微,仅为肾小球充血肿胀,炎性细胞浸润;②肾小管:1d时肾小管部分上皮细胞水肿、空泡变性,3d时肾小管上皮细胞均见水肿、渗出、坏死,管腔内可见红色颗粒状坏死物,肾小管上皮间断性损伤部位可见再生上皮细胞;5d时肾小管上皮细胞仍有水肿、坏死,管腔内坏死物减少;7~10d时肾小管上皮细胞水肿减轻,管腔中坏死物逐渐减少,部分肾小管损伤已修复;14d时肾小管上皮细胞水肿消退,腔内坏死物逐渐溶解消失,肾小管上皮细胞结构基本正常;③肾间质:水肿、充血伴大量炎性细胞浸润;C组(Fig.10-12):pHGF干预后明显减轻了肾脏病理改变,加速了损伤后的修复。①肾小球:充血肿胀明显减轻;②肾小管:1d时可见肾小管上皮细胞水肿减轻,无明显坏死;3d时仅有小部分肾小管上皮细胞出现坏死,管腔内可见少量坏死物,肾小管损伤部位可见较多再生上皮细胞;5d时肾小管上皮细胞轻度水肿,部分损伤肾小管已修复;7~10d时肾小管上皮细胞水肿消退,管腔中坏死物消失,损伤已基本修复;14d时肾小管上皮细胞结构正常。③肾间质:可见炎性细胞浸润。3.血清BUN、Cr测定(table 1)A组:血清BUN、Cr各时段均在正常范围内;B组:BUN于第1d显著升高,第3d达高峰,1d、3d、5d各时间点与A组比较有统计学意义(P<0.05);5d后存活大鼠可逐渐下降,7~14d时段逐渐恢复正常,与A组比较无意义(P>0.05);A、B两组比较Cr变化无统计学意义(P>0.05);C组:BUN在1d、3d时较B组降低,具有统计学意义(P<0.05),5d、7d时段仍较B组降低,但无统计学意义(P>0.05);1d、3d时与A组比较有统计学意义(P<0.05),以后各时间点与A组比较无意义(P>0.05);三组比较Cr变化均无统计学意义(P>0.05)。4 .肾组织匀浆MDA、SOD及GSH-Px变化(table 2)4.1 MDA测定(Fig.1,table 2)B组:染毒后1d、3d和5d各时间点MDA含量明显高于A组(P<0.01),7d、10d时段逐渐下降,但仍高于A组(P<0.05),14d时与A组比较无统计学意义(P>0.05);C组:染毒后1d、3d及5d各时间点MDA均较B组明显降低(P<0.05),7~14d各时间点与B组比较无统计学意义(P>0.05);1d和3d时段高于A组(P<0.05),其它各时间点与A组比较均无统计学意义(P>0.05)。4.2 SOD测定(Fig.2,table 2)B组:染毒后1d、3d时段SOD活力均明显低于A组(P<0.01),5d和7d时段仍低于A组(P<0.05),10d、14d及SOD活力逐渐升高,与A组比较无统计学意义(P>0.05);C组:染毒后1d、3d、5d及7d各时间点SOD活力均较B组升高(P<0.05);但1d与3d时明显低于A组(P<0.01),其它各时间点与A组比较均无统计学意义(P>0.05)。4.3 GSH-Px活性检测(Fig.3,table 2)B组:染毒后1d和3d时GSH-Px活力低于A组(P<0.05),5d及以后各时间点活力逐渐升高,与A组比较无统计学意义(P>0.05);C组:染毒后1d和3d时段GSH-Px活力较B组增高(P<0.05),其余各时间点与B组比较无统计学意义(P>0.05);各时间点与A组比较无统计学意义(P>0.05)。5治疗前后肾组织HGF及TGF-β1的免疫组织化学检测结果(Table 3)5.1 HGF在大鼠肾组织中的表达与分布(Fig.13-25)A组(Fig.13):HGF仅在肾小管少许表达;B组(Fig.14-19):于染毒后1d,即可发现HGF在肾小管上皮细胞的细胞核中表达,3d达高峰,与A组比较有统计学意义(P<0.01),此后开始缓慢下降,5~7d仍强于A组,与A组比较有统计学意义(P<0.05);10~14d以后与A组相比无统计学意义(P>0.05);C组(Fig.20-25):HGF仍主要表达于肾小管上皮细胞的细胞核中,且表达自1~7d各时间点均较B组明显增强(P<0.01),10~14d与B组比较仍有统计学意义(P<0.05);在1~7d各时间点均明显高于A组(P<0.01);10~14d时与A组比较仍有统计学意义(P<0.05)。5.2 TGF-β1在大鼠肾组织中的表达与分布(Fig.26-38)A组(Fig.26):可见TGF-β1在肾小管上皮细胞的胞质中微弱表达;B组(Fig.27-32):染毒后1d,TGF-β1表达明显增强,7d达高峰,1~10d各时间点与A组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01);14d仍有表达,与A组相比仍有统计学意义(P<0.05);C组(Fig.33-38):染毒后1d,TGF-β1在肾小管上皮细胞的胞质中亦出现表达,1~14d各时间点与B组相比均减弱,差异均有统计学意义(P<0.05);但与A组相比,1~7d各时间点TGF-β1的表达明显高于A组,差异具有统计学意义(P<0.01),10~14d与A组比较仍有统计学意义(P<0.05)。结论1.百草枯腹腔注射染毒可引起肾损伤,且主要表现为肾小管上皮细胞损伤,表明百草枯腹腔注射染毒是制造急性肾损伤动物模型的可靠办法;2.百草枯中毒大鼠血清BUN于1d开始升高,3d可达高峰,7~14d可恢复正常,证实百草枯致肾损伤时可出现BUN改变;Cr变化无统计学意义;3.百草枯中毒大鼠体内MDA水平升高、SOD及GSH-Px活力下降,提示体内存在过氧化损伤及氧化-抗氧化失衡,可能是百草枯致肾损伤的机制之一;4.百草枯中毒大鼠肾组织中HGF及TGF-β1主要在肾小管表达,可能是肾小管损伤与修复过程中的一对重要互逆平衡因素;5.促肝细胞生长素治疗后,可明显降低百草枯中毒大鼠肾组织MDA含量,增加SOD及GSH-Px活力,从而减轻氧化应激对肾组织和细胞的损伤;6.促肝细胞生长素可通过促进体内HGF的合成及表达,间接抑制TGF-β1的表达,从而抑制肾小管损伤,促进肾小管上皮细胞修复和再生,减轻百草枯中毒所致肾损伤。