RNA干扰技术对柯萨奇B组3型病毒的抑制作用研究

• 作 者: 陈杰斌
• 机 构: 南华大学
• 出 处: 南华大学
• 发表日期: 2006年01期
• 关键词: 小干扰RNA RNA干扰 柯萨奇B组病毒 衣壳蛋白

第一部分：CVB₃-VP₁ siRNA对CVB₃体外复制的抑制作用 目的：RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，是由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默（silencing）现象。利用RNAi技术研究对CVB₃的复制的抑制作用，观察柯萨奇B组病毒3型衣壳蛋白1（CVB₃-VP₁）特征性小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）对CVB₃复制及VP₁蛋白表达的抑制作用，探索抗CVB病毒感染的基因治疗新的方法。为CVB感染性疾病的治疗提供理论基础。 方法：根据CVB₃ VP₁基因的序列及其结构特征，设计并用化学方法合成4对siRNA。以CVB₃感染HeLa细胞，实验病毒用量为100μL内含100TCID₅₀病毒液／孔，18小时后通过脂质体介导以siRNA转染HeLa细胞，siRNA用量为3μL（60pmol）。七组HeLa细胞分别为转染CVB₃ VP₁-1 siRNA组，转染CVB₃ VP₁-2 siRNA组，转染CVB₃ VP₁-3 siRNA组，转染CVB₃ VP₁-4 siRNA组，转染no silencing-siRNA组，阳性对照组，空白对照组。48h后观察细胞病变的程度、TCID₅₀法测定病毒滴度、用免疫荧光法测定CVB₃-VP₁蛋白表达，RT-PCR法检测CVB₃-RNA的水平。 结果：（1）CVB₃ RNA检测 siRNA组中VP₁-1、VP₁-2和阴性对照组无扩增条带，而阳性对照组与非特异siRNA及VP₁-3、VP₁-4组均可见827bp靶基因的条带。（2）免疫荧光法测定CVB3-VP1蛋白表达半定量分析表明，感染病毒后再转染VP₁-3、VP₁-4组及非特异siRNA与阳性对照组相比较无统计学意义（P＞0.05）；而转染VP₁-1，VP₁-2 siRNA与阳性对照组比较差异有显著性（P＜0.05）。（3）HeLa细胞病理变化 在相差显微镜下观察到在VP₁-3和VP₁-4组大多数细胞肿胀、变圆、卷缩变形及空斑形成，而转染VP₁-1和VP₁-2组的细胞则只有少数细胞死亡。提示VP₁-1和VP₁-2组对CVB₃感染的HeLa细病变程度较轻，具有明显的保护作用，而VP₁-3和VP₁-4的保护作用不明显。（4）病毒滴度测定显示，VP₁-1和VP₁-2 siRNA组病毒滴度为0，而VP₁-3、VP₁-4