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目的：
视网膜色素性炎(RP)是眼部常见的遗传性视网膜变性疾病,全球大约有一百万人发病。RP 主要表现为进行性光感受器细胞死亡和视力丧失。
近年来发现受体酪氨酸激酶基因(MerTK 基因)缺失与 RP的发生有关。MerTK基因是TAM(Tyro3、Axl、MerTK)受体酪氨酸激酶家族的成员,是催化酪氨酸残基磷酸化的酶。
本课题组在对MerTK基因敲除小鼠 RP 模型的研究中发现:MerTK 基因敲除后,RPE 细胞吞噬功能降低。进一步在基因水平对 RPE 细胞研究发现,MerTK基因敲除后 RPE 细胞的mRNA 表达谱发生改变。
MicroRNA(miRNA)是近年来发现的普遍存在于动植物体内的一类非编码调控RNA,长约22nt,通过与其靶 mRNA 互补结合,调控靶基因的表达。
由 miRNA的基因调控作用及课题研究基础推测 miRNA 可能参与 mRNA的表达调控,即 MerTK 信号通路的调节。
本课题的研究目的是检测正常及MerTK基因敲除小鼠RPE细胞中miRNA的表达谱,找出明显上调或下调的miRNA,并通过研究相关miRNA调控的靶基因,推测其在MerTK 信号通路中的作用。
材料和方法
(1)出生4周的wt 和mutant 小鼠,12小时昼夜节律,光照 2 小时和光照12小时后分别断颈处死,每组动物每个时间点各5只,取出眼球后,分别收集视网膜色素上皮细胞(RPE),并用抗S100和抗cytokerin(CK)抗体通过免疫荧光方法检测验证 RPE 细胞的纯度。
(2)通过 miRNA 芯片检测,分别比较 wt 和mutant 小鼠 RPE 细胞在光照2小时和光照10小时的miRNA表达谱,分析 mutant 小鼠 RPE 细胞中miRNA 在昼夜时钟周期中不同光照时间的表达差异。
(3)通过实时定量 PCR的方法,验证 miRNA 芯片检测结果,并通过实时定量 PCR的方法检测 miRNA 靶基因的表达变化。
结果
(1)通过鉴定,证实所取细胞确实为 RPE 细胞,为进一步实验研究奠定了基础。
(2)miRNA 表达谱芯片分别检测 wt 和MerTK 基因敲除小鼠 RPE 细胞中 miRNA的表达,通过对 wt 和MerTK 基因敲除小鼠 RPE 细胞中 miRNA的表达谱比较发现,MerTK 基因敲除小鼠 RPE 细胞中 miRNA的表达谱改变。
(3)qPCR 方法检测 miRNA的表达,结果与 miRNA 芯片检测结果一致。并通过qPCR 方法检测发现 miRNA 调节的与 RPE 细胞吞噬有关的靶基因的表达水平发生改变。
结论
(1)与 wt 小鼠 RPE 细胞相比,mutant 小鼠 RPE 细胞中 miRNA的表达谱在光照2小时和光照12小时均有改变。
(2)mutant 小鼠 RPE 细胞中 miRNA 调节的与 RPE 细胞吞噬有关的靶基因的表达水平发生改变。
(3)miRNA 可能参与 MerTK 信号通路有关的RPE 吞噬过程的调节。