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万古霉素药物常被称为是临床杀死病原菌的最后一道防线,因此耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现和传播给细菌性疾病感染的治疗带来了巨大威胁,其中粪肠球菌是医院感染的主要VRE之一,它可以引起脑膜炎、胆囊炎、心内膜炎、尿路感染及伤口感染等多种疾病。LuxS/AI-2型群体感应(QS)系统是细菌在生长过程中自发产生、检测自诱导分子AI-2并介导细菌之间信息交流的一种重要机制,QS系统多与病原菌的毒力因子产生、菌膜形成和耐药性等有关。目前国内外关于粪肠球菌的LuxS/AI-2型QS系统未被发现,因此研究粪肠球菌LuxS/AI-2型QS系统具有重要理论意义,并取得如下主要结果:(1)利用哈氏弧菌BB170仅对AI-2信号分子产生发光现象的原理,分别检测到三株粪肠球菌V583(序列标准株,VRE)、V309(临床分离株,VRE)和Vxy(临床分离株,无万古霉素抗性)均可以分泌AI-2信号分子,而且V583生长对数中期分泌的AI-2开始诱导BB170发光,稳定期初期的AI-2诱导的发光值达到最大,随后逐渐减弱。(2)在哈氏弧菌和沙门氏菌中,S-腺苷高半胱氨酸(SAH)先后经Pfs和LuxS酶催化反应生成AI-2信号分子。扩增出粪肠球菌的luxS和pfs基因,分别连接到表达载体pGEX-4T-1上,转化至大肠杆菌DH5α(luxS突变株)中,结果粪肠球菌luxS基因可以使DH5α恢复产生AI-2分子的特征,说明粪肠球菌的luxS基因是产生AI-2所必需的。(3)将上述表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,表达、纯化出LuxS和Pfs纯酶,并以SAH为底物,纯化的LuxS和Pfs酶或者重组菌DH5α/pGEX-4T-luxS菌体蛋白为反应酶,体外合成出高活性的AI-2信号分子,而且证实粪肠球菌AI-2的生成途径与哈氏弧菌、沙门氏菌相同。合成的AI-2通过埃尔曼试剂测定浓度,并与4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(MHF,具有类似AI-2分子的活性)比较,得知相同浓度AI-2与MHF的生物活性差别较大。(1)、(2)和(3)结果说明LuxS/AI-2型QS存在于粪肠球菌V583中。(4)为了研究AI-2的生物学功能,将V583培养液分别孵育过量的AI-2 (VA),MHF (VM),冻干的V583培养上清(VS),双向电泳分析差异蛋白,结果鉴定到的差异蛋白较少,主要为下调蛋白,包括代谢、翻译、能量产生等15个相关蛋白。而且AI-2的添加未对粪肠球菌生长产生影响,MHF与AI-2有部分类似功能,半定量RT-PCR验证了双向电泳结果的可靠性。(5) 20μmol/L的AI-2可以促进粪肠球菌菌膜的形成约23 %,2μmol/L的MHF可以促进菌膜的形成约18 %。以上结果表明,粪肠球菌V583存在LuxS/AI-2依赖的QS系统,并且与菌膜的形成有关,双向电泳鉴定到涉及代谢、翻译和细胞壁合成的多个蛋白,这些或许为研究粪肠球菌的致病性和耐药性提供帮助。