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背景和目的:代谢性炎症是由摄入营养物和代谢过剩触发的一种低程度、慢性的系统性炎症,可造成多种炎性分子如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)表达和活性增强。代谢性炎症的发生机制除了饱和脂肪酸等内源性损伤以外,与外源性毒素也有关系,如革兰氏阴性细菌细胞壁的内毒素(LPS)引起的一系列病理改变,通过肠道内毒素激活TNF-α介导的肠道紧密连接蛋白表达改变,导致肠道屏障功能障碍,通透性升高,血液循环和肠道内毒素水平升高,形成代谢性内毒素血症。最近的研究表明动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、肥胖这四种严重危害人类健康的疾病都存在代谢性炎症这一共同特征。中药黄芩苷已被证实具有明确的抗炎作用,中医认为它有清热泻火解毒的功效。本课题组前期研究显示黄芩苷可以降低高脂饮食诱导的小鼠血清内毒素(LPS)水平升高,并且可以抑制LPS导致的IEC-6肠上皮细胞TNF-α升高,对肠上皮细胞紧密连接蛋白有保护作用,但黄芩苷是否直接通过抑制TNF-α诱导的肠上皮细胞损伤,对屏障功能产生影响有待进一步研究。MicroRNA是一种调控基因表达的非编码RNA,在细胞增殖、分化、凋亡、转移等一系列进程中发挥重要功能。本实验结合生物信息学分析技术,从microRNA角度探讨黄芩苷对肠道通透性的影响机制,为中药抗代谢性炎症的应用提供理论基础。方法:一、黄芩苷对TNF-α诱导的IEC-6细胞的保护作用研究IEC-6细胞设置正常对照组、TNF-α模型组、TNF-α+黄芩苷组,用CCK-8检测IEC-6细胞活性;用细胞电阻仪检测IEC-6细胞的通透性,用FITC Annexin V和PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。二、黄芩苷对TNF-α诱导的IEC-6细胞miRNA差异表达谱的生物信息学分析将IEC-6细胞分为TNF-α组和TNF-α +黄芩苷组,TNF-α组给予50 ng/mL的TNF-α处理细胞24 h,TNF-α +黄芩苷组加入40 μg/mL黄芩苷预处理1 h后,再加入50 ng/mL TNF-α刺激24 h,提取细胞RNA,进行microRNA测序。应用生物信息学分析方法,进行miRNA表达差异和聚类分析,预测差异表达的miRNA靶基因,应用DIANA TOOLS mirPath v.3.0软件进行差异表达miRNA靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析。三、黄芩苷通过miR-191a对TNF-α诱导的IEC-6细胞的保护机制1.黄芩苷对TNF-α条件下IEC-6细胞紧密连接蛋白表达的影响将IEC-6细胞分为正常组、TNF-α模型组、TNF-α +黄芩苷组,根据生物信息学分析结果对差异表达的miRNA预测的靶基因紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Claudin-8的表达进行Western Blot检测,采用细胞免疫荧光检测ZO-1细胞间分布情况。2.黄芩苷通过miR-191a对TNF-α诱导的1EC-6细胞紧密连接蛋白ZO-1的影响首先用miR-191a模拟物和抑制物转染IEC-6细胞24 h,用荧光定量PCR和Western Blot检测miR-191a和靶基因ZO-1的表达水平。再将细胞分为正常对照组、黄芩苷组、TNF-α模型组、TNF-α+黄芩苷组、TNF-α+miR-191a抑制剂组、TNF-α +黄芩苷+miR-191a抑制剂组、TNF-α +黄芩苷+miRNA抑制剂阴性对照组、TNF-α +miR-191a模拟物组、TNF-α+黄芩苷+miR-191a模拟物组、TNF-α+黄芩苷+miRNA模拟物阴性对照组,检测miR-191a和ZO-1的表达水平。3.黄芩苷通过miR-191a对TNF-α诱导的IEC-6细胞活性和迁移能力的影响设置正常对照组、黄芩苷组、TNF-α模型组、TNF-α +黄芩苷组、TNF-α +miR-191a抑制剂组、TNF-α +黄芩苷+miR-191a抑制剂组、TNF-p +黄芩苷+miRNA抑制剂阴性对照组。用CCK-8法检测细胞生存率,划痕实验检测细胞迁移能力。结果:1.与正常对照组相比,不同浓度的黄芩苷(10,20,40 μg/mL)对IEC-6细胞增殖无明显影响,10,30,50 ng/mL TNF-p明显降低IEC-6细胞生存率(P<0.05),其中50 ng/mL TNF-p使细胞通透性升高,凋亡率增加。与TNF-p(50 ng/mL)模型组对比,不同浓度的黄芩苷(10,20,40 μg/mL)预处理使细胞生存率显著升高(P<0.01)。同时40 μg/mL黄芩苷预处理可以抑制TNF-α导致的细胞通透性升高,降低细胞凋亡率。2.经过miRNA表达差异分析,黄芩苷预处理组和TNF-p组比较,表达差异的miRNA共40个,其中上调7个,下调33个miRNA表达,KEGG通路分析显示黄芩苷可能调控的靶基因与细胞紧密连接、细胞间隙连接、细胞粘附分子通路等密切相关。GO功能富集分析说明黄芩苷可能影响细胞构成、生物进程、分子功能、细胞核、蛋白连接相关细胞功能。miRNA靶基因预测提示黄芩背可能调控紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-2 和 Claudin-8 的表达。3.和正常组比较,TNF-p处理24 h后,ZO-1表达显著降低,Claudin-1、Claudin-8表达无明显差异,Claudin-2的蛋白表达量明显增加,和TNF-a组比较,黄芩苷预处理对Claudin-1、Claudin-8表达无明显影响,但使ZO-1表达升高,并使Claudin-2的蛋白表达量降低。免疫荧光结果显示,正常IEC-6细胞紧密连接蛋白ZO-1表达连续、均匀,和正常组对比,TNF-α处理后细胞间ZO-1表达降低,且分布不均,和TNF-α组对比,黄芩苷+TNF-α组ZO-1表达增多且分布均匀连续。4.和对照组相比,miR-191a模拟物抑制Z0-1 mRNA和蛋白表达,miR-191a抑制物增加ZO-1 mRNA和蛋白表达(P<0.05)。黄芩苷单独处理24 h对IEC-6细胞ZO-1的表达无明显影响。和正常对照组比较,TNF-α处理24 h后,细胞miR-191a表达明显升高,ZO-1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),黄芩苷预处理使miR-191a表达降低,ZO-1mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与TNF-α+黄芩苷组对比,TNF-α+黄芩苷+miR-191a抑制剂组中ZO-1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05),与TNF-α+黄芩苷组对比,TNF-α+黄芩苷+miR-191a模拟物组中ZO-1mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05)。5.划痕实验显示,与正常对照组相比,单独黄芩苷组(40 μg/mL)对IEC-6细胞的迁移率无明显影响,TNF-α刺激后IEC-6细胞迁移率下降(P<0.05),和TNF-α组相比,TNF-α+黄芩苷组细胞迁移加快(P<0.05),此外和TNF-α+黄芩苷组比较,TNF-α+黄芩苷+miR-191a抑制剂组细胞迁移加快(P<0.05)。结论:1.TNF-α能抑制IEC-6细胞的增殖,促进细胞凋亡,通过升高miR-191a水平使靶基因紧密连接蛋白ZO-1的表达下降,并增加细胞孔隙构成蛋白Claudin-2的表达,使细胞迁移能力降低,破坏细胞间紧密连接结构,使肠上皮细胞通透性升高,屏障功能受损。2.黄芩苷可以抑制TNF-α诱导的IEC-6细胞凋亡和细胞活性损伤,通过抑制miR-191a使靶基因ZO-1表达水平升高,维持细胞间正常紧密连接蛋白ZO-1分布,提高细胞的迁移能力,并降低Claudin-2的表达,保护肠上皮细胞的正常通透性。