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松材线虫，学名Bursaphelechus xylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle，是目前世界上最具危险性的森林病原之一，由松褐天牛等媒介昆虫携带在林间传播，引起松树萎蔫，导致松树毁灭性死亡。给亚洲许多国家和地区及北美、欧洲等国家造成了巨大经济损失。自1982年首次在南京发现以来，该病情在我国迅速蔓延，对我国的森林资源和生态环境造成了严重破坏。目前，松材线虫病防治主要依赖于化学防治，但高毒性的化学防治存在成本高、污染大、易产生耐药性等缺点，破坏生态平衡，危害人类健康。因而，采用具有高效、环保、无污染、不伤害天敌的植物源杀虫剂防治线虫病成为近年来研究的热点和焦点。“回归自然”及农药的无公害化，也是社会和自然科学发展的必然趋势。同时，伴随着生物技术的不断发展，越来越多的生物分子技术被用来防治植物寄生线虫。因此，通过对植物源杀虫剂杀线机理探讨，研究与松材线虫的生长发育、侵染寄生、耐药胁迫、氧化应激等相关基因，寻找新的分子作用靶标，具有重要意义。insulin/IGF-1signaling(ⅡS)路径是线虫中先天性免疫系统主要路径之一，除参与线虫多尔形成外，在线虫寿命、脂肪代谢、应激反应、先天免疫等方面发挥了重要作用。研究ⅡS路径相关基因功能对寻找新的植物源杀虫剂作用靶标具有重要意义。 为了深入研究植物源杀虫剂对松材线虫的作用机理，本研究以松材线虫为研究对象，首次利用高通量测序技术，构建了植物源杀线剂处理组（鱼藤酮药剂处理两个亚致死浓度LC30和LC50）与对照组转录组，系统分析了杀线剂处理组与对照组间转录组差异表达基因。并筛选出松材线虫ⅡS路径相关基因，详细研究了ⅡS路径中Bx Daf-16、BxAge-1、BxAkt及BxSgk-1基因在耐药应激反应方面的功能。主要研究结果如下: 1、基于HiSeq4000高通量测序的植物源杀线剂处理组和对照组转录组分析。 分别构建了鱼藤酮（LC30=1.35μg/mL、LC50=2.60μg/mL）和对照(DMSO)处理组松材线虫混合虫龄的转录组文库，获得212.87MReads，共计69.33G bp数据，其中Q30达到93.27％以上，样品GC含量平均48.82％。共获得14115条Unigene。新基因发掘与分析显示，共发掘了711个新基因。新基因功能注释显示，注释到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG、NR库的新基因个数分别为25、64、57、114、133、96、169、195个。差异表达基因分析显示，鱼藤酮(LC30=1.35μg/mL)处理转录组与对照转录组相比，上调基因151个，下调基因21个。鱼藤酮(LC50=2.60μg/mL)处理转录组与对照转录组相比，上调基因430个，下调基因184个。差异基因功能注释和富集分析显示，注释到COG、GO、KEGG、NR、Swiss-Prot库的差异基因个数分别为189、329、180、511、395个。从注释基因中鉴别出大量耐药解毒、氧化应激相关基因，生长发育、侵染寄生相关基因，免疫信号通路相关基因等等，为后续开展功能基因研究及寻找新的药物靶标奠定了基础。 2、松材线虫ⅡS路径相关基因的CDS克隆与基因分析 根据转录组筛选鉴定，通过RT-PCR克隆得到了ⅡS路径中四个基因BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt、BxSgk-1。(1)松材线虫BxDaf-16基因CDS全长为1533bp，编码510个氨基酸，相对分子质量为57.95kDa，理论等电点为6.55。无信号肽及跨膜区域存在。序列分析显示BxDaf-16包含6个DNA结合位点，1个Forkhead保守结构域，属于FOXO转录因子家族。(2)松材线虫BxAge-1基因CDS全长1539bp，编码512个氨基酸，相对分子质量为60.14kDa，理论等电点为7.22。无信号肽及跨膜区域存在。序列分析显示BxAge-1含有“TEL1”保守结构域，属于PKc_like超家族。(3)松材线虫BxAkt基因CDS全长为1707bp，编码568个氨基酸，相对分子质量为65.54kDa，理论等电点为5.63。无跨膜区及信号肽存在。蛋白序列分析显示BxAkt含有11个磷酸肌醇结合位点及19个ATP结合位点，具有“PH”与“S_TKc”两个保守结构域，属于“PH-like”超家族及“PKc_like”家族。(4)松材线虫BxSgk-1基因CDS全长为1281bp，编码426个氨基酸，蛋白相对分子量为49.90kDa，理论等电点为8.79。无信号肽及跨膜区域存在。蛋白序列分析显示BxSgk-1含有19个ATP结合位点，具有“STKc_SGK”保守结构域，属于PKc_like超家族。蛋白比对分析显示，松材线虫BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt、BxSgk-1蛋白与其它线虫的同源蛋白间高度保守。 3、松材线虫ⅡS路径相关基因的表达分析 利用原位杂交技术，对四个基因在松材线虫中的组织表达进行定位分析，显微观察显示:BxDaf-16基因主要在雄虫的咽部神经环与中肠道处表达，在雌虫的头部神经元与卵巢处表达;BxAge-1基因在松材线虫雌雄虫间的组织表达略有差异，主要在线虫的生殖部位附近表达;BxAkt基因在线虫雌雄虫间表达略有差异，主要在雄虫的生殖部位、肛门神经部位及咽部神经部位表达，在雌虫的咽部神经周围处表达;BxSgk-1基因主要在线虫雄虫的的背部神经脊索处表达，在雌虫的咽前部周围神经及中食道球后部神经附近表达。 利用qPCR法，对四个基因在鱼藤酮、苦参碱及盐酸左旋咪唑药剂胁迫处理时的转录水平进行定量分析。定量结果显示:3种药剂胁迫12h及24h时，BxDaf-16基因表达均上调，推测BxDaf-16基因在松材线虫耐药应激中起到正向调控作用;BxAge-1基因在低浓度的盐酸左旋咪唑药剂胁迫时的表达呈下降趋势，而在鱼藤酮及苦参碱药剂胁迫时的表达规律不明显;BxAkt基因在苦参碱及盐酸左旋咪唑胁迫12h时的表达下降，在其他处理时的表达变化不规律;BxSgk-1基因在盐酸左旋咪唑胁迫12h时的相对表达下降，而在其它处理时的表达总体上调。BxAge-1、BxAkt、BxSgk-1三种激酶基因均与松材线虫的耐药应激、免疫防御密切相关。总之，作为重要的潜在药物靶标基因，松材线虫ⅡS路径中四个基因是杀线机理研究与未来新型杀线剂研究的重点。 4、松材线虫ⅡS路径相关基因的RNAi 体外合成BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt及BxSgk-1四个靶标基因的dsRNA，利用体外浸泡法进行RNA沉默试验。qPCR检测沉默效果，同时进行鱼藤酮、苦参碱及盐酸左旋咪唑药剂胁迫处理实验，观察dsRNA处理组与DEPC-H2O处理组间的线虫死亡率变化，研究四个基因在线虫应激、免疫防御方面的具体功能。qPCR结果表明:dsRNA处理后松材线虫与对照组线虫相比，BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt及BxSgk-1基因转录水平均明显下降，沉默效率分别为40.13％、48.18％、68.87％、38.30％。表型观察显示:与对照组线虫相比，dsBxDaf-16处理的线虫表型呈“蜷缩打结”，摆动频率明显下降;dsBxAge-1处理的线虫表型及摆动频率无明显差异;dsBxAkt处理的线虫表型无明显差异，成虫的摆动频率下降;dsBxSgk-1处理组的线虫表型无明显差异，线虫摆动频率明显下降。生测试验结果显示:与对照处理的线虫相比，dsBx Daf-16处理的线虫在3种药剂胁迫12h及24h时的死亡率明显增加。dsBxAge-1处理的线虫在3种药剂胁迫12h及24h时的死亡率总体下降。dsBxAkt处理的线虫除在鱼藤酮药剂胁迫12h时的死亡率明显上调外，在其它药剂处理时的死亡率总体下降。dsBxSgk-1处理的线虫除在苦参碱药剂胁迫24h时的死亡率明显上调外，在其它药剂胁迫处理时的死亡率显著下降。 5、松材线虫ⅡS路径中四个基因联合沉默初步探究 在四个基因单独沉默的基础上，采用体外浸泡dsRNA法进行基因联合沉默干扰试验。结合qPCR、生测试验等方法，系统研究了四个基因在松材线虫耐药胁迫及免疫防御防御的功能，初步探究松材线虫ⅡS路径中四个基因间的基因关系。qPCR结果显示:BxDaf-16与BxAge-1共沉默、Bx Daf-16与BxAk共沉默、BxDaf-16与BxSgk-1共沉默、BxAge-1与BxAkt共沉默、BxAge-1与BxSgk-1共沉默、BxAkt与BxSgk-1共沉默后的靶标基因的转录水平均下降，基因联合沉默成功。 药剂处理试验显示:与BxDaf-16基因单独沉默相比，BxDaf-16与BxAge-1基因共沉默、BxDaf-16与BxAkt基因共沉默、Bx Daf-16与BxSgk-1基因共沉默的线虫，在药剂胁迫时的死亡率总体下降。BxAge-1与BxAkt基因共沉默、BxAge-1与BxSgk-1基因共沉默、BxAkt与BxSgk-1基因共沉默的线虫，在不同药剂胁迫时死亡率变化不规律。