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研究背景线粒体磷酸甘油脱氢酶(Mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase,mGPDH)是与核黄素相连接的线粒体呼吸链脱氢酶,m GPDH既是呼吸链的重要组成部分也是调控磷酸甘油穿梭活性的重要元件,负责在将3磷酸甘油(G3P)转化为磷酸二羟丙酮(DHAP)的同时将胞质内糖酵解等产生的还原当量(NADH)转运入线粒体氧化。因此m GPDH是胞质和线粒体生物活动的重要连接,在许多生理和病理情况下的细胞能量生成中扮演着重要角色。骨骼肌占人体体重约40%,在维持身体运动和物质代谢平衡方面起着重要作用。足够的骨骼肌质量是骨骼肌发挥其各项功能的基础,成肌分化是骨骼肌形成和质量维持的关键环节。糖尿病和肥胖是威胁现代人健康的重要因素,研究发现肥胖和糖尿病情况下骨骼肌的再生受损,导致骨骼肌质量的丢失,运动和代谢功能障碍,增加疾病的发病率和死亡率,使这些疾病成为全球的重大负担。然而肥胖和糖尿病损伤骨骼肌再生的机制未明,还缺乏有效的干预措施。我们这项研究的目的是阐明m GPDH在骨骼肌再生中的特殊作用,并观察其在肥胖和糖尿病相关的骨骼肌修复受损中的意义。研究方法1.mGPDH对骨骼肌分化的作用:1.1 Western-blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)观察mGPDH在骨骼肌细胞C2C12分化过程中表达量的改变。1.2使用siRNA和过表达质粒干预mGPDH在分化过程中的表达量,观察m GPDH对骨骼肌分化的影响:免疫荧光染色和多核细胞计数观察骨骼肌分化的水平,Western-blot和qRT-PCR观察m GPDH表达的改变对分化相关基因表达水平的影响。2.mGPDH对骨骼肌再生的作用:2.1 Western-blot和qRT-PCR检测mGPDH在骨骼肌再生中表达量的变化;2.2 mGPDH敲除鼠骨骼肌再生状况的观察:(1)骨骼肌组织切片、HE、免疫荧光和马松染色观察敲除鼠和野生型对照骨骼肌再生的情况;(2)Western-blot和qRT-PCR检测敲除鼠和野生型对照骨骼肌再生相关因子(myogenin和myh3)表达水平。3.mGPDH调节骨骼肌分化的机制研究:3.1 ATP水平和氧耗速率检测,用以观察改变m GPDH表达对骨骼肌分化过程中能量的影响;3.2 qRT-PCR检测分化过程中线粒体生物合成和氧化呼吸酶的改变,观察mGPDH对线粒体代谢能力的影响;3.3 mGPDH对AMPK通路激活的影响:Western-blot观察m GPDH对AMPK及其下游通路蛋白活性的影响,利用AMPK活性抑制剂compound C验证mGPDH是否通过激活AMPK来调节骨骼肌分化。4.增加m GPDH表达对肥胖和糖尿病小鼠骨骼肌再生的影响:4.1 Western-blot和免疫组织化学染色(IHC)检测肥胖病人和正常人骨骼肌中mGPDH的表达及分布;4.2 Western-blot比较肥胖和糖尿病与正常小鼠小鼠骨骼肌中m GPDH在基础水平和再生中的表达水平的差异;4.3 qRT-PCR和HE染色观察增加mGPDH表达量对肥胖和糖尿病小鼠骨骼肌再生的影响。研究结果1.m GPDH对骨骼肌细胞分化的影响:(1)Western-blot和q RT-PCR检测发现mGPDH在分化过程中表达量逐渐升高。(2)免疫荧光,Western-blot和q RT-PCR检测发现干扰m GPDH表达后骨骼肌的分化受损,多核的肌管的形成减少,成肌调节因子(myogenin和MyHC)表达量降低,而过表达mGPDH可以促进肌细胞分化为更大的肌管,成肌调节因子也相应表达增加。2.m GPDH对骨骼肌再生的影响:(1)Western-blot和q RT-PCR显示m GPDH的表达在骨骼肌再生过程中升高,(2)HE、免疫荧光和马松染色显示缺乏mGPDH的骨骼肌再生受损,Western-blot和q RT-PCR证明缺乏mGPDH的骨骼肌在损伤后不能激活成肌调节因子。3.m GPDH调节骨骼肌分化的机制:(1)细胞分化过程中干扰m GPDH使ATP水平和氧耗速率降低,而过表达m GPDH则出现相反结果。(2)干扰m GPDH使线粒体生物合成和氧化呼吸相关酶减少,而过表达使其增加。(3)Western-blot提示mGPDH可以影响AMPK信号通路的激活,并且Western-blot和免疫荧光检测证明利用AMPK抑制剂compund C可以阻断mGPDH对分化的积极作用。4.增加m GPDH可以缓解肥胖和糖尿病导致的骨骼肌再生障碍:HE染色观察到在ob/ob鼠和STZ鼠中AAV9干预组骨骼肌再生明显比对照组更良好,新生肌纤维更多更粗,肌肉整体结构更完整。qRT-PCR显示AAV9治疗明显增加了m GPDH及成肌调节因子的表达水平。结论1.m GPDH促进骨骼肌的分化,2.m GPDH敲除鼠骨骼肌损伤后再生困难,3.m GPDH通过激活AMPK信号通路调节骨骼肌的分化,4.增加mGPDH可以缓解肥胖和糖尿病导致的骨骼肌再生障碍。