论文部分内容阅读
目的:本课题通过对大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)进行高糖高脂干预,建造糖尿病心肌病肥厚模型,通过检测MAPK信号蛋白明确其对糖尿病心肌病中炎性反应的影响。方法:实验分为三部分:(1)采用随机数字表法,将体外培养的H9c2心肌细胞随机分组,每组设6个平行孔:对照组、高糖高脂A(葡萄糖33mmol/L+棕榈酸钠250μmol/L)、高糖高脂B(葡萄糖33mmol/L+棕榈酸钠500μmol/L)、高糖高脂C(葡萄糖33mmol/L+棕榈酸钠1000μmol/L)不同时间(12h、24h、36h、48h)处理组。采用荧光定量PCR(RT-PCR)技术分别检测心肌肥大相关指标心房钠尿肽(ANP)、α-肌动蛋白(α-SKA)的m RNA表达;利用苏木精-伊红染色法(HE染色)对各组细胞进行染色,观察高糖高脂对H9c2心肌细胞肥大程度的影响;检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,观察高糖高脂对H9c2心肌细胞损伤程度的影响。(2)结合第一部分实验,采用随机数字表法,将体外培养H9c2心肌细胞分组,每组设立6个平行对照孔:对照组、高糖高脂组(葡萄糖33mmol/L+棕榈酸钠500μmol/L)处理24小时。利用蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测p-ERK/T-ERK、p-JNK/T-JNK、p-p38/T-p38的活化程度,观察高糖高脂与MAPK家族信号活化关系。(3)结合前两部分实验,采用随机数字表法,将体外培养H9c2心肌细胞分组,每组设立6个平行对照孔,对照组、高糖高脂组、抑制剂组(SB203580+高糖高脂组)。采用流式细胞术检测各组细胞中活性氧(ROS)的含量;通过化学检测法检测各组一氧化氮(NO)的水平;ELISA法检测各组细胞3-硝基酪氨酸(3-NT)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)的分泌程度,观察高糖高脂对H9c2心肌细胞炎症通路的影响及MAPK家族与炎性反应之间的关系。结果:1.高糖高脂处理导致H9c2细胞呈时间和浓度依赖性肥大和损伤。与对照组相比,高糖高脂处理后,ANP表达随着浓度和时间的逐渐增加而升高,且在36h高糖高脂B处理组ANP的表达量达到高峰(P<0.01);相比对照组而言,高糖高脂促进α-SKA表达,但α-SKA的表达在36h高糖高脂B处理组达到最高(P<0.05),与ANP的结果一致;与对照组相比,H9c2细胞的表面积变化与高糖高脂呈时间浓度依赖性,此外在36h高糖高脂B处理组,细胞的表面积变化最显著(P<0.01),但36h高糖高脂C处理组的细胞形态改变异常;同时H9c2细胞上清中LDH的活性与高糖高脂处理间呈浓度及时间依赖性(P<0.05)。据此,采用高糖高脂B(葡萄糖33mmol/L+棕榈酸钠500μmol/L)干预细胞36h为后续实验的干预浓度和时间。2.高糖高脂处理后H9c2细胞MAPK信号途径显著活化。与对照组相比,高糖高脂组中ERK、JNK、p38磷酸化水平明显提高,其中p-ERK和p-JNK的水平分别增加了1.39倍和1.47倍(P<0.05),而p-p38的活化水平增加了3.34倍(P<0.01)。3.高糖高脂显著诱导炎症反应变化并可被p38 MAPK抑制剂抑制。与高糖高脂组相比,抑制剂组(SB203580+高糖高脂组)可降低ROS含量、NO水平、3-NT含量、IL-6和IL-1β的分泌量(P<0.05)。结论:1.高糖高脂可增加ANP及α-SKA的表达并使H9c2细胞表面积显著增加,且可使细胞上清中的LDH水平升高,这提示高糖高脂可显著诱导H9c2细胞肥大并使其发生损伤。2.高糖高脂可以增加MAPK家族活化程度,其中p38尤为明显,提示在糖尿病心肌病的发生过程中伴随有炎性信号通路活化。3.p38抑制剂可抑制高糖高脂诱导的ROS、NO、3-NT、IL-6、IL-1β水平的提高,提示p38 MAPK是介导高糖高脂导致糖尿病心肌病病理过程发生发展炎性反应的重要因素。