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1目的间充质干细胞(MSCs)是一种具有成纤维细胞外观、多向分化潜能的多能干细胞。MSCs最早在骨髓中发现,随后研究者们陆续在脐带、脐血、胎盘、脂肪、肌肉、皮肤、牙周等组织中分离出MSCs。当前,几乎从所有的成体组织、器官中都能成功分离出MSCs。研究显示MSCs可以通过直接接触或分泌细胞因子起到调节免疫的作用。MSCs同时是肿瘤基质的重要组成部分,能够影响肿瘤局部免疫功能,并有直接或间接影响肿瘤生长、侵袭和凋亡的作用。一些研究表明,MSCs具有促进肿瘤生长、转移的作用；另一些研究报道则显示MSCs具有抑制肿瘤生长的作用。MSCs不但能够影响肿瘤细胞的生物学功能,同时也能被肿瘤细胞所影响,甚至有研究显示,MSCs能够发生恶性转化,转化为肿瘤干细胞,获得肿瘤细胞的相关特性。肾细胞癌是泌尿系统常见的实体性肿瘤,对化疗、放疗不敏感。已经有报道在正常肾组织中成功分离出间充质干细胞,但肾细胞癌组织中MSCs是否存在、肾细胞癌组织内MSCs生物学特性是否发生改变、肾细胞癌组织内MSCs对癌细胞的影响等问题,国内外尚无报道。此外,中药黄芪具有抑制肾癌的作用已经得到认可,但具体机制尚不明确。黄芪是否通过影响MSCs进而抑制肾癌,也需要进一步研究。本次研究在正常肾组织和肾细胞癌组织内分离出MSCs,比较两种来源MSCs的生物学特性,观察两种来源MSCs对肾癌细胞的迁移和增殖的影响以及相应的分子机制,并观察黄芪对MSCs的影响,从而探讨MSCs在肾细胞癌生长和转移中的作用,为如何治疗肾细胞癌寻找新的靶点。2方法实验一正常肾组织和肾细胞癌组织中间充质干细胞的分离和鉴定(1)分别取7例正常肾组织标本和8例肾透明细胞癌组织标本,胶原酶+胰酶消化。培养基选用90%α-MEM+10%胎牛血清(FBS)。应用贴壁分离筛选法分离、纯化MSCs。贴壁细胞达培养瓶80%以上后传代。(2)观察各代正常肾来源问充质干细胞(KN-MSCs)和肾癌来源间充质干细胞(KC-MSCs)的生物学特性。包括：①观察各代MSCs的镜下形态；②CCK-8法检测两种MSCs的增殖曲线；③PI染色法检测两种MSCs的细胞周期；④流式细胞仪检测两种MSCs的表面标志分子(CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、HLADR等)的表达情况；⑤验证两种MSCs的成脂肪分化能力和成骨分化能力。实验二间充质干细胞对肾细胞癌迁移和增殖的影响(1)应用肾透明细胞癌系(786-0),分三组,分别为空白组、KN-MSCs组和KC-MSCs组,作细胞划痕实验。其中KN-MSCs组和KC-MSCs组培养基内分别加入收集后浓缩的两种MSCs培养基上清液。(2)应用肾透明细胞癌系(786-0),分三组,分别为空白组、KN-MSCs组和KC-MSCs组,CCK-8法检测三组肾透明细胞癌株(786-0)的增殖能力。其中KN-MSCs组和KC-MSCs组培养基内分别加入收集后浓缩的两种MSCs培养基上清液。(3)将裸鼠分为三组,分别为空白组、KN-MSCs组和KC-MSCs组,观察皮下种植瘤的生长情况。其中,空白组应用肾透明细胞癌系(786-O), KN-MSCs组应用肾透明细胞癌系(786-O)+KN-MSCs, KC-MSCs组应用肾透明细胞癌系(786-O)+KC-MSCs。(4)提取两种MSCs的总RNA,逆转录为cDNA, Realtime-QPCR法检测两种MSCs的部分细胞因子(IL-8、CCL5、TNF-α、SDF-1、VEGF、PDGF、FGF。EGF。ICAM-1和N-Cadherin等)的表达情况。(5)应用KN-MSCs,分为两组,分别为空白组和实验组。提取两种MSCs的总RNA,逆转录为cDNA, Realtime-QPCR法检测两种MSCs的IL-8和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)的表达情况。其中,实验组培养基内加入收集后浓缩的肾透明细胞癌系(786-0)培养基上清液。实验三黄芪对正常肾组织和肾细胞癌组织中间充质干细胞生物活性的影响(1)应用KN-MSCs和 KC-MSCs,培养基中分别添加不同浓度的黄芪注射液,用CCK-8法检测不同组MSCs的增殖能力。(2)应用KN-MSCs和 KC-MSCs,培养基中分别添加不同浓度的黄芪注射液,检测不同浓度黄芪注射液影响下两种MSCs的成脂肪分化能力和成骨分化能力。(3)应用KN-MSCs和 KC-MSCs,培养基中分别添加不同浓度的黄芪注射液,提取不同组MSCs的总RNA, Realtime-QPCR法检测两种MSCs的部分细胞因子(IL-8、CCL5、TNF-α、SDF-1、VEGF、PDGF、FGF、EGF、ICMA和N-Cadherin等)的表达情况。3结果7例正常肾组织标本中有5例成功提取出长梭状、贴壁生长细胞；8例肾透明细胞癌组织标本中有6例成功提取出长梭状、贴壁生长细胞。两种细胞皆形态均一,传代至15代以上,形态无明显变化。两种细胞增殖曲线皆表现为传代后第3天进入指数期,第11天进入平台期。对两种细胞第6代进行细胞周期分析,显示KN-MSCs中Go/G1期细胞占93.78%,KC-MSCs中Go/G1期细胞占93.96%,符合绝大多数干细胞处于静止期的特点。流式细胞仪检测两种细胞第六代的免疫表型,显示两种细胞皆高表达CD105、CD73和CD90,阳性率高于95%；两种细胞皆不表达CD45、CD34和HLADR,阳性率低于2%。两种细胞均具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力。证实本研究成功地从正常肾组织和肾透明细胞癌组织中提取出MSCs。应用肾透明细胞癌系(786-0)作细胞划痕实验,结果显示空白组和KN-MSCs组肿瘤细胞迁移能力差异不显著,KC-MSCs组的肿瘤细胞迁移能力大于空白组和KN-MSCs组。CCK-8法检测三组肾透明细胞癌株(786-0)的增殖能力,结果显示KC-MSCs组的增殖能力大于空白组和KN-MSC组。检测三组裸鼠皮下种植瘤的生长情况,结果显示KN-MSCs组和KC-MSCs组的皮下种植瘤体积和重量均大于空白组,KC-MSCs组的皮下种植瘤体积和重量大于KN-MSCs组。提取两种MSCs的总RNA,逆转录为cDNA, Realtime-QPCR法检测两种MSCs的部分细胞因子(IL-8、CCL5、TNF-α、SDF-1、VEGF、PDGF、FGF、EGF、ICAM-1和N-Cadherin等)的mRNA表达情况,结果显示KC-MSCs对IL-8和PDGF的表达能力大于KN-MSCs.加入浓缩的肾透明细胞癌系(786-0)培养基上清后的KN-MSCs,表达IL-8和PDGF的能力增强。培养基中加入黄芪后,CCK-8法检测KN-MSCs和KC-MSC s的增殖曲线,显示黄芪组的KN-MSCs和 KC-MSCs增殖能力较强。成脂肪和成骨诱导实验显示黄芪组的KN-MSCs 和 KC-MSCs无明显成脂肪分化和成骨分化。Realtime-QPCR法检测黄芪作用后的MSCs细胞因子的表达,显示MSCs对多种细胞因子,包括IL-8和PDGF的表达能力下降。4结论(1)正常肾组织和肾透明细胞癌组织中存在MSCs,并可以成功分离、纯化。(2)体内、体外实验显示,相比来自正常肾组织来源的MSCs,肾透明细胞癌组织来源的MSCs具有促进肾透明细胞癌系(786-0)迁移、增殖的能力。(3)肾透明细胞癌组织来源的MSCs高表达IL-8和PDGF,可能是促进肾癌细胞增殖和迁移的机制。(4)肾透明细胞癌细胞可导致MSCs高表达IL-8和PDGF。(5)黄芪可以下调MSCs对多种细胞因子,包括IL-8和PDGF的表达。