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人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)作为一种具有广阔临床应用前景的细胞因子类药物,其结构与功能的关系至今所知甚少,既有的已进入临床应用产品尚存在着诸如生物活性较低、使用量较大等缺点.为探讨以上问题,该文利用盒式突变技术对天然结构的G-CSF cDNA进行突变,并将突变后的G-CSF分子展示于噬菌体表面,从而构建成突变体文库.以重组G-CSF受体及依赖细胞株对该文库进行筛选,通过对不同突变株的亲和力、生物学活性及核苷酸序列分析,初步探讨了G-CSF结构与功能的关系,为进一步改造G-CSF奠定了基础,主要研究内容及结果如下:一、人粒细胞集落刺激因子结构与功能关系的研究.将G-CSF cDNA克隆于噬菌体表面展示载体pCANTAB-5E,经培养、扩增,得到了纯化的重组噬菌体.ELISA,Dot blot及Western blot结果证明,重组噬菌体表面有G-CSF的融合表达;用依赖细胞株(NSF-60)测定重组噬菌体的生物学活性,结果表明,融合表达于噬菌体表面的G-CSF能够刺激其依赖细胞株(NSF-60)的生长,说明G-CSF能以天然的活性状态展示于噬菌体表面,从而为进一步利用噬菌体表面展示技术研究G-CSF结构与功能关系提供了可依据.二、G-CSF受体的克隆与表达.G-CSF受体是G-CSF结构与功能关系研究中不可缺少的工具,同时也是具有潜在临床应用价值的可溶性细胞因子受体类药物之一.利用RT-PCR技术,从胎盘组织中成功地扩增并克隆了人粒细胞集落刺激因子受体膜外区的主要活性部位BN及CRH片段.将BN及CRH片段的cDNA克隆于原核高效表达载体PBV-222,实现了G-CSF受体膜外区BN及CRH片段的高效表达.用G-CSF亲和柱与纯化后表达产物进行的亲和层析及受体结合实验证明,该产物能特异性结合G-CSF且具有较高的亲和力(BN Kd=26.8 nmol/L;CRH Kd=9.8 nmol/L).由于原核表达产物的复性率较低且没有糖基化,作者又将CRH cDNA克隆于杆状病毒表达载体pFastbacI,转染昆虫细胞SF-9后,获得了重组杆状病毒.病毒感染细胞裂解液的SDS-PAGE及Western blot结果证明CRH得到成功表达.用G-CSF亲和层析柱对表达产物进行纯化,得到了纯度达95%以上的产物.受体结合实验结果表明,该产物能特异性地结合G-CSF,其亲和力(Kd=3.5nmol/L)比原核表达产物高.G-CSF受体膜外区在昆虫细胞的成功表达与纯化为G-CSF噬菌体突变文库的筛选提供了必需的工具,也为其临床应用研究奠定了基础.总之,该文首次利用噬菌体表面展示技术探讨了G-CSF结构与功能的关系,为进一步应用蛋白质工程改造G-CSF提供了条件,同时筛选到了两株较高活性的G-CSF突变体.此研究的成功为蛋白质结构与功能关系的研究(特别是细胞因子的结构与功能研究)探索出一条新思路和新方法,也将给其它一些蛋白质结构与功能的研究以启示.同时,在国内首次将G-CSF受体膜外区在原核表达系统及杆状病毒表达系统表达,为G-CSF结构与功能的研究提供了必需的实验材料,并为G-CSF可溶性受体的临床应用研究奠定了基础.