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猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）属于冠状病毒亚科δ冠状病毒属成员。临床研究证实PDCoV与猪肠道冠状病毒PEDV（porcine epidemic diarrhea virus）、TGEV（transmissible gastroenteritis virus）感染引起的症状类似,主要表现为仔猪呕吐、腹泻以及死亡。自从2014年美国爆发PDCoV,亚洲多个国家均报道了PDCoV的存在,引起很大关注。作为新出现的猪肠道冠状病毒,PDCoV的感染及致病机制仍不太清楚。在感染早期,拮抗宿主干扰素（Interferon,IFN）产生及其诱导的抗病毒反应是病毒建立感染的重要策略。本课题组的前期研究显示PDCoV感染能抑制仙台病毒（Sendai virus,SeV）诱导的IFN-β产生,但其编码蛋白在IFN-I信号通路中的作用及作用机制均不清楚。冠状病毒编码的非结构蛋白nsp5,也称3C样蛋白酶,负责前体多聚蛋白大部分位点的切割、加工,产生成熟的非结构蛋白,在病毒的复制过程具有重要作用。有研究证实多种病毒编码的3C蛋白酶或3C样蛋白酶广泛参与宿主免疫反应的调节。但PDCoV nsp5在宿主免疫反应中的调节作用尚无报道。因此,本论文对其在IFN-I信号通路中的作用及作用机制开展了深入研究。1.PDCoV nsp5拮抗IFN-I产生的机制通过双荧光素酶实验检测发现过表达PDCoV nsp5抑制SeV诱导的IFN-β产生及IRF3和NF-κB的激活,且这种抑制作用依赖于nsp5的蛋白酶活性。Western blot检测显示PDCoV nsp5靶向切割NEMO抑制RIG-I/MDA5信号通路,并且PDCoV感染能降解内源性NEMO。进一步通过构建NEMO一系列的点突变及截短突变体,确定PDCoV nsp5切割NEMO的P1位点为231位的谷氨酰胺（glutamine,Q）残基,并证明切割产物丧失激活下游信号的能力。上述结果揭示了PDCoV nsp5拮抗IFN-β产生的新特性。2.PDCoV nsp5拮抗IFN-I信号转导的机制为了分析PDCoV nsp5对IFN-I信号转导的影响,利用双荧光素酶实验在HEK-293T细胞和PK-15细胞中检测了过表达PDCoV nsp5对IFN-α介导的ISRE（IFN-stimulated response element）启动子活性的影响,结果显示过表达PDCoV nsp5能显著抑制IFN-α介导的ISRE启动子活性。实时荧光定量PCR检测也证实PDCoV nsp5显著抑制IFN-α介导的ISGs（IFN-stimulated genes）转录。进一步通过Western blot检测,发现PDCoV nsp5显著抑制内源性STAT2（signal transducer and activator of transcription 2）的表达及磷酸化,并呈剂量依赖性地切割STAT2,而且在病毒感染的LLC-PK1细胞也检测到内源性STAT2的切割条带。通过对STAT2进行一系列的点突变,发现PDCoV nsp5介导的切割位点位于STAT2的Q685、Q758残基。与全长STAT2相比,切割片段诱导ISGs的能力明显减弱,说明PDCoV nsp5介导的STAT2切割是拮抗IFN-I信号转导的有效机制。3.PDCoV nsp5拮抗DCP1A抗病毒作用的机制鉴于PDCoV nsp5蛋白酶活性在拮抗IFN-I信号通路中的重要作用,推测PDCoV nsp5也可能靶向IFN-I信号通路的抗病毒效应分子ISG。为了筛选nsp5可能切割的ISG分子,将PDCoV nsp5与本实验室构建的14个猪源ISG表达质粒分别共转染至HEK-293T细胞,Western blot实验结果显示,PDCoV nsp5呈剂量依赖性地切割pDCP1A（porcine mRNA-decapping enzyme 1a）,并且切割位点位于Q343残基。在PDCoV感染的IPI-2I细胞内,也能检测到内源性pDCP1A的切割。与全长pDCP1A相比,切割产物pDCP1A1–343、pDCP1A344–580丧失抑制PDCoV感染的能力。然而,抵抗切割的突变体pDCP1A-Q343A表现出比野生型pDCP1A更强的抗病毒效果。进一步对其它7个哺乳动物冠状病毒编码的nsp5进行分析,发现7种冠状病毒的nsp5均能切割pDCP1A以及hDCP1A（human DCP1A）,且切割位点可能一致。以上结果揭示PDCoV nsp5通过切割DCP1A拮抗其抗病毒活性,且作用机制在不同冠状病毒之间具有保守性。