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前言青光眼视神经病变是全球首位不可逆致盲眼病。主要表现为以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGCs)进行性丢失为病理基础的特征性视神经损害和视野缺损。目前认为高眼压是主要的危险因素和始动因素。然而,单纯降低眼压只能从一定程度上缓解病情的发展却不能遏制继发性RGCs死亡及其轴突的溃变。从而使得临床上有效控制视神经病变发展的手段有限。青光眼和线粒体视神经病变在病理特征和临床表现上的诸多相似性使线粒体在青光眼视神经病变中的作用受到越来越多的重视和关注。此外,现已证实线粒体功能障碍在阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性疾病中起了重要作用。青光眼也属于神经变性类疾病,具有这些疾病的共同特点：年龄相关性、神经元选择性、进行性丢失。这些证据都提示线粒体在青光眼发展中扮演重要角色的可能性。那么：线粒体在RGCs进行性死亡过程中发生了哪些改变?是否可以解释临床上一些患者在眼压有效控制以后,视力损害仍然持续加重的现象?这些问题尚未见报道。线粒体被称为细胞内的能量工厂,对于细胞的存活和死亡起着至关重要的调控作用。线粒体DNA(mtDNA)是核外唯一的遗传物质,因其特殊的组成结构和细胞内定位使mtDNA较nDNA易受损伤、突变率高。同时,mtDNA几乎不存在非编码区,任何位点的突变都可能被转录,造成蛋白质表达改变,产生严重后果。RGCs作为一类代谢旺盛的神经元,包体和轴突中线粒体的含量非常高。这也就决定了RGC对线粒体功能异常的敏感性。最近有学者在青光眼患者外周血中发现mtDNA突变增加和ATP合成障碍,提示mtDNA损伤及线粒体功能下降是青光眼发病的危险因素之一。然而,这些研究仅局限于患者外周血,还无法解释青光眼视神经病变过程中RGCs和视神经进行性损伤,甚至在眼压有效控制后视力损害仍持续加重的原因。关于青光眼视神经病变发展过程中,RGCs mtDNA的突变、可能的突变机制、以及mtDNA突变在细胞进行性死亡中的作用等问题,未见报道。为此,本研究以慢性高眼压Wistar大鼠模型为对象,研究了mtDNA、mtDNA修复酶、线粒体复合物功能在高眼压和眼压恢复正常后的变化,并通过体外细胞培养实验探讨了高眼压mtDNA突变的可能机制及mtDNA突变与线粒体功能障碍的关系。此外,还深入探讨了mtDNA突变或损伤引起视网膜神经节细胞进行性死亡的可能机制。第一部分慢性高眼压视网膜神经节细胞mtDNA及线粒体功能变化目的：以大鼠慢性高眼压大鼠模型为研究对象,系统研究在高眼压期间和眼压恢复正常后RGCs的丢失特征,以及RGCs中mtDNA损伤与突变、mtDNA修复能力、线粒体功能的动态变化。初步揭示mtDNA异常在青光眼RGCs死亡中的重要性。方法：选用8周龄Wistar大鼠,通过巩膜上静脉烧灼(EVC)方法建立慢性高眼压模型。荧光金逆行标记RGCs后视网膜铺片观察、计数RGCs的存活数量。SMI32免疫荧光标记视神经观察其丢失情况。采用免疫吸附的方法分离纯化RGCs后抽提线粒体、mtDNA.nDNA.线粒体蛋白、细胞浆蛋白、总mRNA.以long-extensionPCR方法检测mtDNA损伤、DNA随即突变捕获的方法检测mtDNA突变率.western blot他realtime PCR方法检测mtDNA修复酶OGG1、MYH和POLG的表达、生化方法检测线粒体功能,包括线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率和ROS含量。结果：80%术眼在EVC术后1天时眼压升高,平均值为25.3±1.6mmHg,在这些眼中高眼压能持续至6周者约占35%(18.7±1.1mmHg).术后6-7周因血管再通导致眼压逐步降至正常,直至6个月实验结束。对侧假手术眼眼压稳定维持在12.16±0.89mmHg。RGCs计数发现不仅在高眼压期间其数量持续减少,眼压恢复正常后仍进行性下降,术后2、4、6个月RGCs丢失的比例依次为24.6±0.17%(p<0.05)、30.4±0.78%(p<0.01)和34.8±0.15%(p<0.01)。SMI32阳性染色定量分析也证实轴突在眼压恢复正常后的6周至6月期间继续丢失了12%。EVC术后2周检测到mtDNA损伤,并不断增加,但在高眼压期间与对照组相比无统计学意义。眼压恢复正常后继续呈进行性加重趋势,于2、4、6个月时检测mtDNA损伤分别是对照组的1.5倍(p<0.05)、2.8倍(p<0.01)和3.4倍(p<0.01)。mtDNA突变随机捕获实验进一步证实了这个结果：眼压增高后2-4周可检测到mtDNA突变增多,眼压恢复正常后,突变未见减少反而继续增加,术后2、4、6个月Taql1427位点的突变率分别是对照组的7.6倍(p<0.05)、10.3倍(p<0.01)和16.8倍(p<0.01)；Taql8335位点mtDNA突变率在术后6周和6月分别是对照组的9.9倍(p<0.01)和12.7倍(p<0.01)。高眼压后RGCs的mtDNA修复酶OGG1、MYH和POLG在线粒体内表达下降,即使眼压恢复正常仍未见缓解。而mRNA表达却表现出与蛋白表达的不一致,眼压升高后迅速增多,随后逐渐下降,但OGG1和MYH始终未降至正常水平以下。高眼压后RGCs中线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ的活性与对照组相比下降,其中复合物Ⅰ在6周、2、4、6月时下降36%,(p<0.05)、39%(p<0.05)、41%(p<0.05)和43%(p<0.05)；复合物Ⅲ下降更明显,第2周下降35%(p<0.05),4月和6月时分别下降了56%(p<0.01)和62%(p<0.01)。术后6月时复合物Ⅰ和Ⅲ中由mtDNA编码的亚基cyt B和ND5的蛋白含量仍显著减少。RGCs内线粒体ATP生成率在眼压升高后出现一过性增高,是对照组的5.2倍(p<0.01),随即下降,眼压恢复正常后仍未改善,至6个月实验结束时下降了48%,差异出现显著性(p<0.05),表现为不可逆性减少。ROS在眼压升高后1周迅速升高,1周时达到峰值(为对照组1.6倍,p<0.05)。随后ROS含量快速下降直至正常。术后4个月和6个月时检测到ROS含量再次升高。结论：高眼压持续6周后,即使眼压恢复正常,RGCs及其轴突仍呈进行性丢失；高眼压后,RGCs线粒体DNA损伤和突变增加,且在眼压恢复正常后仍进行性、累积性加重,伴随mtDNA修复能力持续低下和线粒体功能不可逆性障碍。第二部分压力对线粒体DNA损伤及功能影响的体外研究目的：明确压力是否可以引起mtDNA的损伤和突变,探讨mtDNA突变和损伤与线粒体功能障碍的关系。方法：为在体外模拟慢性高眼压状态,本实验采用加压培养大鼠脑星形胶质细胞,压力设定为30mmHg。于加压后12、24、48、72、96和120小时收集细胞,利用long-extension PCR口随机突变捕获实验检测mtDNA的损伤和突变。Real-time PCR和westeren blot方法测定mtDNA修复酶OGG1、MYH和POLG的表达。DCF-DA方法检测ROS含量。Lent i-shPOLG转染星形胶质细胞诱导mtDNA损伤和突变的细胞模型,western blot检测由mtDNA编码的线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ的亚基ND4、ND5.ND6和cyt B的蛋白含量。进而采用生化方法检测复合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率,JC-1荧光探针测定线粒体膜电位的变化。结果：加压24小时即可检测到mtDNA损伤增加,72小时较对照组增加>40%(p<0.05)。加压48小时后Taq11427位点突变增加,是对照组的2.2倍(p<0.05),120小时达到5.1倍(p<0.001)。Taq18335位点突变增加趋势与Taq11427一致,120小时达到对照组的4.9倍(p<0.001)。加压后细胞ROS含量未见显著改变。OGG1、MYH和POLG的mRNA表达在加压后迅速升高,12小时达到峰值,分别是对照组的11.2倍(p<0.01)、6.3倍(p<0.05)和1.8倍(p<0.05)。随后OGG1、MYH逐渐恢复正常直至120小时,而POLG则持续下降至正常水平以下。线粒体内OGG1、MYH和POLG蛋白表达在加压后48小时开始下降,于72小时和120小时分别下降了56%(p<0.05)、60%(p<0.01)；38%(p<0.05)、63%(p<0.01)和39%(p<0.05)、37%(p<0.05)。细胞转染Lenti-shPOLG后5天和10天,mtDNA损伤较对照组分别增加了16%(p>0.05)和46%(p<0.01).mtDNA编码的线粒体复合物亚基ND5、ND6和cyt B的蛋白表达显著下降,与对照组相比分别下降43%(p<0.05)、32%(p<0.05)和34%(p<0.05)。复合物Ⅰ和Ⅲ的活性在转染后10天时分别下降22.6%(p<0.05)和40.8%(p<0.05),线粒体膜电位下降了63%(p<0.001)。转染后第9天ATP生成率是对照组的67.9%(p<0.05),显著减少。结论：异常升高的压力可以直接导致mtDNA损伤和突变,一方面直接导致了线粒体功能障碍；另一方面,mtDNA损伤和突变又可造成线粒体膜电位下降,从而引起mtDNA修复酶表达下降,三者可形成恶性循环,最终使mtDNA损伤和突变进行性、累积性加重。第三部分mtDNA损伤和突变加重视网膜神经节细胞的易损性目的：通过建立RGCs mtDNA损伤和突变的动物模型,研究mtDNA损伤和突变增多后RGCs的凋亡情况,以及对青光眼常见损伤因素如眼压升高和谷氨酸浓度增加的敏感性。方法：设计三条shPOLG模版DNA,以pSilencer1.0-U6为载体构建shPOLG和对照质粒,real-time PCR和westernblot方法检测POLG的表达,筛选出抑制效率最佳的质粒并将其克隆到pAAV-CMV-GFP载体中,构建AAV2-shPOLG载体、扩增、纯化。Wistar大鼠玻璃体腔注射AAV2-shPOLG建立RGCs mtDNA损伤和突变模型。注射后2、6、12个月western blot检测RGCs中POLG蛋白表达、LX-PCR和mt突变随机捕获实验检测mtDNA损伤和突变,DCF-DA法检测ROS含量,明确建模是否成功。取注射后12个月的大鼠视网膜下注射谷氨酸或行巩膜上静脉烧灼手术(EVC),1周后处死大鼠,进行视网膜TUNEL原位检测,Di工逆行标记RGCs后视网膜铺片计数存活RGCs数量。Western blot检测RGCs中裂解的caspase-3的含量,以明确RGCs的死亡是否属于凋亡。结果：AAV2-shPOLG玻璃体腔注射后2、6、12个月,mtDNA损伤较对照组增加21%、31%(p<0.01)和63%(p<0.01),Taql1427位点突变率分别是对照组的6.5倍(p<0.001)、9.3倍(p<0.001)和17.1倍(p<0.001)。RGCs中ROS含量未见显著改变。TUNEL结果显示：rAAV2-shPOLG组中RGCs凋亡数量是对照组的2.3倍(p<0.05)；rAAV2-shPOLG联合EVC组和rAAV2-shPOLG联合谷氨酸组中RGCs凋亡数量分别较相应的对照组增加了21%(p<0.05)和35%(p<0.01)。裂解的caspase-3含量在rAAV2-shPOLG.rAAV2-shPOLG联合EVC和rAAV2-shPOLG联合谷氨酸组中分别增高了43%(p<0.05)、41%(p<0.05)和48%(p<0.05)。结论：线粒体DNA损伤和突变可以不依赖压力直接引起活体内RGCs凋亡；也使RGCs在受到眼压、谷氨酸损伤后的凋亡数量增加。