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子痫前期（preeclampsia，PE）是指妊娠20周以后出现的，以高血压和蛋白尿为主要症状的功能紊乱综合征，该疾病发病率约2%-8%，患病高危因素包括孕妇高龄、慢性肾病、慢性高血压、抗磷脂抗体综合症、既往有子痫病史等。子痫前期是妊娠期高血压疾病进展的严重阶段，可发展成为子痫，后者主要表现为昏迷、抽搐等症状，是引起孕产妇死亡率和围产儿并发症升高的主要原因之一，目前唯一有效的治疗措施是终止妊娠。虽然子痫前期的病因尚未完全阐明，但现在公认的诱发因素有：胎盘滋养层细胞浅着床、滋养细胞过度凋亡、胎盘缺血缺氧、胎盘血管重塑障碍以及系统性内皮损伤等。 近年来，有很多研究认为子痫前期可能是一类胎盘源性疾病，胎盘滋养层细胞过度凋亡与该病的发生关系密切。滋养层细胞过度凋亡，使得自身植入过浅，继而导致胎盘螺旋动脉重塑障碍，这是子痫前期疾病发生病理变化的直接原因。现已发现许多原因均可导致滋养细胞凋亡，例如氧化应激反应、内质网应激、胰岛素样生长因子、滋养细胞凋亡调节蛋白以及遗传和免疫学因素等。以上因素都会影响胎盘滋养细胞的增殖和浸润能力，导致其凋亡加剧，继而胎盘植入能力降低，引发胎盘血管重铸障碍，并最终诱发子痫前期。内质网应激作为一条诱发凋亡的新途径，现已成为当前研究的热点。且已有研究提示：内质网应激及其诱发的滋养细胞凋亡与子痫前期的发生密切相关。 作为一种膜性细胞器，内质网在蛋白质的合成、复制以及折叠过程中发挥着重要作用。当细胞受到低氧刺激、能量或营养缺乏、钙离子稳态失衡或病毒感染时，发生内质网功能紊乱，损害其蛋白折叠功能，从而导致细胞内蛋白折叠错误或非折叠蛋白过度聚集，干扰细胞功能，此过程称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）。ERS能够激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR），后者是降低机体内过多的蛋白质负荷、并维持内环境稳态的保护性措施，但是，持续过强的ERS能够产生大量的异常蛋白，这些蛋白质在细胞内堆积，可以激活下游的凋亡信号分子，导致细胞凋亡，最终引起疾病发生。葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein-78, GRP78）的激活可作为ERS发生的标志，ERS发生时，可激活其下游的三种与UPR相关的信号转导蛋白：蛋白激酶R样内质网激酶（Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK）、肌醇激酶（Inositol-requiring kinase, IRE-1）和转录活化因子6（Activating Transcription Factor, ATF6），它们可以改变特定靶基因的转录和翻译水平，减少细胞内的未折叠蛋白，从而维持细胞的正常生理功能。当发生持续或严重的内质网应激时，这三种信号分子均可激活下游的凋亡信号通路，如 C/EBP 同源蛋白 CHOP （ Growth arrest and DNA damage-inducible gene 153, GADD153 ）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 12(Cysteinyl aspartate specific proteinase12，Caspase12)等，以诱发细胞凋亡，这就是ERS导致细胞凋亡的基本过程。在ERS导致细胞凋亡的三条信号通路中，PERK通路是最重要的一条。首先， GRP78 与 PERK 解离使之活化，活化的 PERK分子磷酸化真核翻译启动因子（Eukaryotic initiation factor-2α，elf-2α），诱导活化转录因子4（Activating transcription factor 4，ATF4）分子表达，随后ATF4促进CHOP的翻译，进而降低B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的翻译水平，并导致细胞凋亡。因而，PERK分子处于持续的活化状态，便可经CHOP 信号通路促进细胞凋亡发生。尽管PERK、ATF6和IRE1均能促进CHOP的翻译，但PERK-eIF2α-ATF4的活化才是CHOP基因转录必须的。因此GRP78/PERK/CHOP信号通路在ERS导致细胞凋亡的过程中起着非常关键的作用。 白细胞介素1β（Interleukin–1β，IL-1β）是可由多种细胞产生的一种细胞因子，具有免疫调节和内分泌功能。现在，已有研究发现IL-1β可引起ERS及其相关的细胞凋亡，并因此参与了许多疾病的发展过程。另一方面，子痫前期患者血清和胎盘中的IL-1β水平比正常妊娠妇女显著升高，这暗示着IL-1β也与子痫前期的发生、发展有关。然而，IL-1β是否可通过ERS相关的滋养细胞凋亡引起子痫前期的发病，目前尚无定论。 孕酮（progesterone）是由卵巢黄体细胞分泌的一种类固醇激素，其作用主要是促进孕卵着床和维持妊娠。近年来，孕酮的其他作用逐渐被发现。例如，孕酮还具有中枢神经调节和保护作用。有研究表明孕酮可以降低缺血再灌注引起的脑损伤还可以抑制神经细胞的凋亡。还有学者提出孕酮能减少IL-1β所引起的绒毛膜癌细胞凋亡。但孕酮是否可抑制子痫前期滋养细胞的过度凋亡，从而对子痫前期起类似的保护作用，目前尚不明确。另外，还有研究发现子痫前期孕妇胎盘中的孕酮水平较正常妊娠妇女明显降低，提示孕酮水平下降可能与子痫前期的发病有关。但孕酮在子痫前期疾病进程中，以及在ERS相关的细胞凋亡与子痫前期疾病互作过程中，是否发挥了一定作用，目前尚无文献报道。我们设想：孕酮可能通过抑制内质网应激来减缓IL-1β引起的滋养细胞凋亡，从而可能对子痫前期起到一定的保护作用。本课题将对这一假设进行实验验证。 目的： 本研究旨在探讨ERS诱发的滋养细胞凋亡参与子痫前期发病的分子机制，并在此基础上深入研究孕酮对ERS及其相关性细胞凋亡的影响，推测孕酮在子痫前期发病过程中的作用及机制，以期为探索子痫前期的病因及防治办法提供新的思路。方法： 1. 选取2014年5月至2015年3月在青岛大学附属医院住院治疗并分娩的65名患者作为研究对象，其中早发型子痫前期患者30例，作为子痫前期组（PE组，n=30），并分别选取15名早产孕妇（PD组，n=15）和20名正常足月妊娠妇女作为对照（NP组，n=20）。 2. 酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测并比较三组孕妇血清中孕酮水平。所有孕妇于妊娠的30-34周（其中正常足月妊娠妇女于常规产检时采血，早产及子痫前期患者于分娩前采血）空腹采集肘静脉血5mL，分离获得血清，保存至-80℃冰箱备用。 3. 所有孕妇经剖腹产或阴道分娩终止妊娠后，在娩出30分钟内无菌收集胎盘组织，随后用生理盐水清洗残余的血液等杂质，将其中一部分用4%多聚甲醛溶液固定，另一部分切成1×1×1cm3的组织块，储存在液氮中备用。 4. 免疫组织化学法对胎盘组织中的GRP78、磷酸化PERK(p-PERK)、ATF4、CHOP等内质网应激通路的主要蛋白进行测定；采用定量即时聚合酶链锁反应（ quantitative real time polymerase chain reaction ， qRT-PCR ）法检测胎盘组织中GRP78、PERK、ATF4、CHOP的mRNA含量；采用蛋白印迹（Western blot）法检测各组胎盘组织中GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白的含量。 5. 利用人绒癌细胞株BeWo细胞做体外实验，分别采用不同浓度的IL-1β（1ng/mL, 10ng/mL和100ng/mL）刺激细胞24h和10ng/mL的IL-1β作用不同时间（3h，6h，12h和24h）诱发内质网应激，并用流式细胞术（Flow Cytometry/financal capacity model，FCM）测定细胞凋亡率，qRT-PCR和Western blot法检测在ERS状态下BeWo细胞内GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP等分子的变化。 6. 小干扰RNA(Small interfering RNA ，siRNA)技术沉默PERK基因，检测在siPERK状态下，BeWo细胞对IL-1β刺激的反应。 7. 用不同浓度的孕酮（1nM，10nM，100nM和1000nM）预处理BeWo细胞30min后，再用10ng/ml 的IL-1β刺激细胞，随后采用FCM测定细胞凋亡情况，qRT-PCR和Western blot法检测在ERS状态下BeWo细胞内GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP等分子的变化。 8. 用30μM米非司酮（RU486，孕酮受体拮抗剂）预处理BeWo细胞后再用100nM的孕酮和10ng/ml 的IL-1β刺激细胞，然后采用FCM测定细胞凋亡情况， qRT-PCR和Western blot法检测在ERS状态下BeWo内GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP等分子的变化。 结果： 1. PE组孕妇血清中孕酮水平明显低于早产组及正常妊娠组孕妇（P＜0.01）。 2. 三组孕妇胎盘组织中均可见内质网应激通路GRP78/PERK/CHOP相关蛋白的阳性染色，但在PE组中染色的强度显著高于早产组及正常妊娠组。其中GRP78、p-PERK和ATF4蛋白的阳性染色主要在合体滋养细胞、细胞滋养细胞以及绒毛基质细胞的胞浆内，而CHOP蛋白在这三种细胞的细胞浆和细胞核中均可见阳性染色。 3. PE组孕妇胎盘组织中GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP分子的蛋白及mRNA含量明显高于早产组及正常妊娠组孕妇（P＜0.05）。 4. 不同浓度IL-1β作用不同时间均可使人胎盘滋养细胞BeWo凋亡率明显升高（P＜0.01），且内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP分子的蛋白及mRNA水平也明显上升（P＜0.05）。 5. 沉默PERK后，IL-1β诱导BeWo细胞发生凋亡的能力显著下降，差异有显著性（P＜0.01） 6. 不同浓度的孕酮预处理后，IL-1β诱导BeWo细胞发生凋亡的能力也明显减弱（P＜0.01），且GRP78、p-PERK、PERK、ATF4和CHOP分子的蛋白及mRNA水平也显著下降（P＜0.05）。 7. 加入30μM的孕酮受体拮抗剂米非司酮（RU486）预先培养BeWo细胞后，发现孕酮对IL-1β刺激后Bewo细胞发生凋亡的保护作用明显减弱（P＜0.01）。而GRP78、p-PERK、PERK、ATF4和CHOP分子的蛋白及mRNA表达量又显著回升（P＜0.01）。 结论： 1. 子痫前期患者存在血清孕酮水平降低及胎盘内质网应激相关蛋白水平的升高，表明孕酮低水平及ERS相关性细胞凋亡参与了子痫前期的发病。 2. IL-1β可通过GRP78/PERK/CHOP通路，诱发ERS及其相关性细胞凋亡。 3. 孕酮可抑制IL-1β诱发的ERS及其相关性细胞凋亡，提示孕酮在ERS诱发子痫前期过程中起保护作用。 孕酮在ERS诱发子痫前期的发病过程中起到了很好的保护作用，解释这一现象对探讨孕酮和ERS及其相关性细胞凋亡之间的关系打开了新的视角，并为子痫前期的临床防治提供了新的理论基础。