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研究背景:受饮食习惯、生活方式和社会压力等因素影响,心肌缺血和心肌梗死及其导致的心衰仍严重影响居民的身体健康和生活质量,其中涉及的中青年患者也在不断增多。研究发现,当心肌受损后可导致内质网、线粒体功能障碍,触发包括细胞焦亡在内的多种细胞死亡途径,导致心脏功能受损。临床使用益气活血中药治疗,可有效改善患者症状和心脏功能。而益气活血药主要包括黄芪50g,生晒参10g,当归15g,川芎15g,三七6g,是以中医气血理论（气虚血瘀、气滞血瘀）为理论基础而创立,为导师临床治疗心肌缺血缺氧、心肌损伤以及心肌梗死后各种遗留症状的经验效方,其作用主要是有益心气,促进血液运行和疏通脉络,本课题组在前期研究中已经证明益气活血药能够改善心肌梗死患者疼痛、胸闷、气短等的症状,明显改善心脏射血功能和心脏形态,可以改善大鼠心肌梗死后炎症反应对心肌的损伤,减轻血清中炎症细胞因子分泌水平。研究目的和意义:探究心肌梗死后内质网应激与细胞焦亡的相互作用和调控机制,详细研究心肌梗死的病理生理过程,揭示益气活血药防治心肌缺血、心肌梗死的作用机制和靶点,对于心梗的临床治疗和新药的研发有重要理论意义和实际应用价值。研究方法:本课题内容分为动物实验和细胞实验两部分。动物实验:购买雄性SD大鼠（200±20g）,适应性喂养三天后,结扎左冠状动脉前降支构建急性心梗动物模型。术后根据心电图情况,选取符合要求（5个及5个以上病理Q波）的成模大鼠并随机分为4组:模型组（Model,M）,益气活血组（YQHX,Y）,培哚普利组（Perindopril,P）和只穿线不结扎的假手术组（Sham,S）,于术后第二天给予相应药物和蒸馏水灌胃。前期研究结果表明益气活血药改善心肌缺血、减轻心肌梗死的作用以益气药和活血药2:1时作用最为显著,且服用28天疗效更佳显著。28天时间点还是心梗后心衰的时间窗,模拟临床急性心梗导致心衰的病理情况。因此本实验观察灌胃28天后,各组大鼠的心脏超声情况,HE染色观察各组大鼠心肌细胞状态,评价各组大鼠心脏功能;透射电镜观察心肌组织超微结构,免疫荧光染色观察TXNIP、GSDMD分布及表达情况;免疫蛋白印记法观察各组大鼠梗死边缘区心肌组织中GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达情况,揭示心肌梗死后梗死边缘区组织内质网应激和细胞焦亡变化情况及益气活血药的调节作用。细胞实验:采用H9c2心肌细胞系复制缺糖缺氧模型,根据课题组前期研究结果,并考虑益气活血药冻干粉的存放时间,选用冻干粉200μg/ml、300μg/ml和400μg/ml浓度进行观察。将心肌细胞分为:对照组（C）;缺糖缺氧模型组（M）;200μg/ml益气活血药组（Y2）;30μg/ml益气活血药组（Y3）;400μg/ml益气活血药组（Y4）。根据课题组的前期研究成果,选用造模12h时的时间点观察益气活血药对中轻度心肌细胞损伤的保护作用。采用CCK-8试剂盒观察各组心肌细胞的活力,测定各组细胞中LDH和ROS水平,筛选出益气活血药调节氧化应激水平的最佳浓度为300μg/ml。为进一步观察内质网应激和细胞焦亡间的关系,使用内质网应激抑制剂4-PBA,并将心肌细胞以40×104密度随机分为5组:对照组（C）,缺糖缺氧模型组（M）,益气活血药组（Y）,4-PBA抑制剂组（4-PBA）,益气活血药组+4-PBA抑制剂组（Y+4-PBA）。通过Hoechst 33342/PI双染检测各组心肌细胞细胞焦亡率,免疫蛋白印记法观察各组心肌组织中GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达情况。实验结果:1.超声结果评价各组大鼠左室心功能情况。各组大鼠相应干预28天后,与假手术组相比,M组大鼠的左室射血分数（EF）和左室短轴率（FS）显著降低（p<0.01）,LVAWd、LVIDd、LVIDs 也都显著升高（p<0.01）,LVPWs 也有升高（p<0.05）,而、LVAWs降低（p<0.01）。益气活血药干预后可显著改善各组大鼠心功能,促进各组超声相应指标向正常范围恢复。2.各组大鼠梗死边缘区组织HE染色的心肌细胞情况。可见S组心肌细胞排列整齐,结构完整,细胞核位于细胞中央,无炎性细胞浸润;M组心肌细胞形态受损,细胞肿胀,细胞核散乱,形态位置都发生变化,心肌纤维断裂,结构破坏,胞浆着色不均,排列紊乱,细胞间隙显著增大,有大量炎性细胞浸润;Y组和P组边缘区组织可见心肌细胞肿胀,但整体结构完整,炎性细胞较M组减少,可见少量心肌纤维断裂,心肌细胞间隙略有增宽。3.透射电镜观察各组超微结构的变化。S组大鼠心肌Z线、M线清晰,粗细肌丝清晰排列整齐,线粒体结构完整,双层膜清晰可见,线粒体内基质颗粒和线粒体嵴排列清楚,内质网结构正常。心梗28天后,M组心肌细胞内超微结构紊乱,线粒体肿胀破裂,线粒体嵴模糊甚至消失,细肌丝断裂,粗肌丝堆积,肌原纤维断裂,内质网肿胀,多处可见空泡样结构。而药物干预组粗细肌丝融合分界不清,内质网、线粒体肿胀,线粒体嵴模糊,结构尚完整。5.免疫组化染色TXNIP、GSDMD的情况。TXNIP在假手术组少有表达,模型组显著增加,阳性细胞率大幅度提高。益气活血药和培哚普利组可减少TXNIP的阳性率表达。GSDMD在模型组广泛表达,强阳性染色细胞率较假手术组显著增多,用药组干预后GSDMD的蛋白阳性率可明显降低6.各组大鼠梗死边缘区组织内质网应激和细胞焦亡相关蛋白表达情况。蛋白免疫印迹法结果显示:与 S 组相比,M 组 GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11 蛋白表达水平都显著增高（p<0.01）,而益气活血药和培哚普利可不同程度的降低各组蛋白表达,发挥相应调节作用（p<0.05）。7.益气活血药对缺糖缺氧H9c2心肌细胞的保护作用。与C组相比,缺糖缺氧12h后心肌细胞活力显著降低（p<0.01）,而Y2、Y3、Y4可不同程度的提高心肌细胞活力,保护其免受或少受缺糖缺氧的损伤,其中Y3的效果最佳。又继续探索了不同浓度益气活血药对各组细胞LDH和ROS的影响,结果显示益气活血药可降低缺糖缺氧心肌细胞LDH、ROS水平,其中Y3显示出更好的效果,故在本课题接下来的实验中,选用300μg/ml的益气活血药浓度进行机制探究。我们继续观察了 C、M、Y（300μg/ml）、4-PBA和Y（300μg/ml）+4-PBA五组心肌细胞的细胞存活率和LDH表达水平。结果显示,与C组相比,M组细胞存活率显著降低（p<0.01）,平均降至40%左右。在药物和抑制剂的干预下细胞存活率都明显增加（p<0.05）。虽然Y、4-PBA和Y+4-PBA三个组的细胞存活率程增加趋势,但三者没有统计学差异（p>0.05）。模型组细胞上清中LDH量显著增高（p<0.01）,平均可达400U/L左右。Y、4-PBA和Y+4-PBA干预后都可明显减少LDH的释放（p<0.01）,Y组与Y+4-PBA组相比,差异具有统计学差异（p<0.01）,Y+4-PBA组LDH的减少程度更佳显著。8.心肌细胞细胞焦亡率的情况。采用Hoechst 33342/PI双染后可见C组细胞淡蓝染,细胞密度高,细胞大小正常,基本没有红染细胞。M组细胞核蓝染高亮,细胞密度降低,细胞体积增大,大量红染细胞。而使用抑制剂和中药干预后,都可以降低焦亡细胞比率,细胞密度也较M组增加。9.益气活血药对缺糖缺氧心肌细胞内质网应激和细胞焦亡相关蛋白的影响。与S组相比,M 组 GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达水平都显著增高（p<0.01）,益气活血药和抑制剂干预都可降低相关指标的表达,而抑制剂作用更佳显著。当益气活血药与抑制剂联用时,可进一步降低其表达水平（p<001）。研究结论:1.益气活血药可通过改善缺血心肌细胞超微结构损伤而提高心梗后心功能,改善心梗后的收缩功能,减小梗死面积。2.益气活血药通过调节内质网应激和细胞焦亡相关蛋白,减少心肌细胞死亡,挽救缺血心肌。3.内质网应激抑制剂4-PBA可显著抑制心肌细胞焦亡相关指标表达,表明细胞焦亡可以由内质网应激途径触发并加重细胞焦亡的损伤作用,该作用可能与TXNIP/NLRP3途径有关。而益气活血药可通过抑制内质网应激TXNIP/NLRP3途径,缓解内质网应激抑制细胞焦亡,减轻心肌细胞损伤,且从研究结果显示,益气活血药的作用机制与IRE1 α诱导的相关途径密切相关,这将是进一步研究该课题的重点方向。4.益气活血药减轻内质网损伤,改善了“气虚”的状态,提高了受损心脏功能运行的动力,为从现代科学角度阐释中医“气血”理论提供了研究基础。