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γ-PGA是由某些芽孢杆菌产生的一种粘稠的胞外聚合物,由D-谷氨酸(D-Glu)和L-谷氨酸(L-Glu)单体通过α-氨基与γ-羧基以酰胺键连接而成。它具有生物可降解性、可食性、对人体和环境无毒性等优点。因此,是一种应用前景广泛的生物材料。
然而,根据报道,在微生物合成γ-PGA中的会伴随着产物γ-PGA的降解,这种降解跟γ-PGA降解酶有关,它是一组可以水解γ-PGA分子链中γ-酰胺键的酶。
根据文献上已经报道的地衣芽孢杆菌ATCC14580(DSM13)γ-PGA降解酶基因的序列设计引物,利用PCR技术从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC9945A中克隆出一段长约1.2kb的基因片段,将其插入pMD19-T-simple载体扩增,经克隆测序得到一段1245bp的ywtD全长序列。利用NCBI的Blast分析,该基因序列与地衣芽孢杆菌WX-02γ-PGA降解酶基因(ywtD)、地衣芽孢杆菌ATCC14580(DSM13)γ-PGA降解酶基因(ywtD)的同源性都达到了94％(图9)。将该片段进一步亚克隆至载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-ywtD;经DNA测序证实插入序列和读码框的正确性后,转化至工程菌大肠杆菌(Escherichia coli,E Coli)BL21(DE3)中,在LB/Kan(34μg/ml)中37℃振荡培养至培养液OD为0.8左右时,加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG进行诱导4h,收集菌体超声破碎后进行SDS-PAGE电泳,在45kDa处出现一条明显的蛋白条带,其分子量与表达产物YwtD的理论分子量相符。经对诱导温度、诱导时间、诱导剂IPTG浓度进行优化后,得到一个较佳的诱导表达可溶性YwtD的表达条件。将诱导细胞高压破碎后,收集上清,经Ni-IDA亲和树脂纯化并Western Blotting分析证实表达蛋白的免疫原性;最后初步研究了该降解酶的降解性质。酶解反应证实该表达产物具有降解γ-PGA的活性。