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目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病,其最主要的病理特征是大脑黑质多巴胺能神经元进行性退变以及路易小体形成。PD患者主要表现为进行性加重的静止性震颤,肌强直,运动迟缓以及姿势平衡障碍等。PD发病早期临床症状轻或者不典型,一般患者在多巴胺能神经元减少约50%和（或）纹状体内多巴胺水平减少70%-80%时才会出现典型的运动症状,这导致PD在早期发生误诊和漏诊的概率增加,因此寻找与PD相关的生物学标志物具有重要意义。去乙酰化酶Sirtuin家族蛋白在细胞代谢,抗衰老以及促进DNA修复等多方面发挥重要作用。SIRT1是目前研究最为深入的Sirtuin蛋白,该基因定位于人类染色体10q21.3,它以组蛋白和多种非组蛋白作为底物,通过其去乙酰化作用调节基因转录,染色体稳定性以及靶蛋白活性,进而参与一系列生理病理过程的调节,包括细胞周期,能量代谢,细胞衰老以及神经保护等。SIRT1在胚胎的脑组织中高水平表达,提示SIRT1在神经元或者大脑发育过程中起到重要作用。最近研究表明SIRT1可以抑制帕金森等神经退行疾病的发展。Micro RNA是长度约为20-24个核苷酸的小RNA,通过与靶基因m RNA 3′非编码区的碱基配对调节靶向m RNA的降解或者翻译抑制,对基因进行转录后调控。miRNAs参与调控细胞的生长发育,分化代谢以及增殖凋亡等多个生物学过程。miRNA异常表达与人类疾病相关,其中就包括神经退行性类疾病。部分miRNAs的异常表达已在一些体外/体内PD模型以及受PD影响的人脑组织样本中得到证实。在本文中我们将分析SIRT1在帕金森细胞模型中发挥的潜在作用。同时,还将进一步研究其上游可能的miRNAs,探明miRNAs/SIRT1调控帕金森病细胞模型生物学功能可能的分子机制。研究方法:1.细胞培养:本实验所用细胞为PC12细胞,该细胞来源于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤,它对神经生长因子NGF具有可逆的神经元显形反应。PC12细胞购于中国典型培养物保藏中心。细胞培养所用培养基为包含10%灭活马血清,5%胎牛血清的DMEM培养基。培养条件为37℃,5%CO2及饱和湿度。2.帕金森细胞模型构建:PC12细胞用诱导型DMEM培养基（含1%灭活马血清及10%胎牛血清）进行培养,经过NGF-beta（50ng/ml）连续诱导7天。MPP+（800μM）加入诱导后的PC12细胞中处理24小时,构建帕金森细胞模型。3.细胞转染与干扰:SIRT1质粒及空载质粒购于美国Origene公司,SIRT1 si RNA及non-targeting si RNA购于美国Dharmacon公司。miR-141-3p mimic,miR-141-3p inhibitor及对照购于广州锐博生物技术有限公司。转染试剂Lipofectamine 3000及Dharma FECT购于美国Thermofisher公司,转染试剂按照产品说明的剂量和方法进行使用。4.Western blot:提取样本总蛋白使用RIPA细胞裂解液。本实验所用的抗体为一抗SIRT1,α-syn,Nos1,TNF-α,p-IκB,β-actin以及辣根过氧化物酶标记的二抗。采用ECL发光法。5.流式细胞术:细胞凋亡水平,收集细胞并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入Annexin V-FITC以及PI染色试剂,避光孵育,并用流式细胞仪检测细胞凋亡水平变化。线粒体膜电位水平,收集细胞并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入JC-1荧光染料,恒温孵育45分钟。PBS缓冲液温和漂洗并重悬细胞。采用流式细胞仪分析细胞中线粒体膜电位的变化。ROS含量,收集细胞并温和漂洗细胞。细胞混合液中加入Cell Rox荧光染料,37℃条件下避光孵育30分钟。PBS缓冲液温和漂洗细胞并重悬细胞。采用流式细胞仪分析细胞ROS含量水平。6.荧光素酶报告基因实验:构建荧光素酶报告基因质粒,并与miR-141-3p mimic共转染于PC12细胞中,检测荧光强度分析SIRT1是否为miR-141-3p的直接作用靶基因。7.统计分析:统计分析使用SPSS 22.0软件。处理组与对照组实验结果采用Student′s t检验法。p<0.05表示存在统计学意义。结果:1.PC12帕金森细胞模型构建。PC12细胞通过NGF诱导生成不分裂交感神经样类细胞。诱导后的PC12细胞形成广泛的神经突触网络,同时细胞中TH m RNA表达水平上升。使用MPP+（800u M,24小时）处理NGF诱导后的PC12细胞,构建帕金森细胞模型。2.PC12细胞帕金森细胞模型中SIRT1表达下调,miR-141-3p表达上调。通过Western blot方法检测发现帕金森细胞模型中SIRT1的表达量下调,α-syn,Nos1表达量上调,通过实时荧光定量PCR方法检测发现帕金森细胞模型miR-141-3p的表达量上调。免疫荧光实验验证帕金森细胞模型中α-syn发生聚集,由单体转变为低聚物形式。3.SIRT1及miR-141-3p调控PC12帕金森细胞模型的凋亡水平及线粒体功能。SIRT1表达上调后,PC12细胞凋亡水平降低,ROS含量水平减少,线粒体膜电位上调。相反,SIRT1表达下调后,PC12细胞凋亡水平上升,ROS含量水平增加,线粒体膜电位水平下调。转染miR-141-3p mimic后,PC12细胞凋亡水平上升,ROS含量水平增加,线粒体膜电位水平下调。转染miR-141-3p inhibitor后,PC12细胞凋亡水平降低,ROS含量水平减少,线粒体膜电位上调。4.SIRT1调控PC12细胞中NF-κB信号通路及相关指标表达水平。SIRT1表达上调后,PC12细胞中NF-κB信号通路活性被抑制,p-IκB的表达量下调。α-syn,Nos1,TNF-α,IL-1β,IL-6的表达量下调,bcl-2的表达量上调。ELISA检测细胞上清液中炎性因子的含量,显示SIRT1过表达,TNF-α,IL-1β,IL-6含量降低。细胞经过NF-κB抑制剂处理后,SIRT1对其下游指标TNF-α以及Nos1的调控作用被逆转。5.miR-141-3p通过靶基因SIRT1调控PC12帕金森细胞模型的线粒体功能。荧光素酶报告基因实验结果显示将miR-141-3p mimic与SIRT1野生型质粒共转染于PC12细胞后,细胞的荧光强度降低。转染miR-141-3p mimic后,线粒体膜电位降低。转染miR-141-3p mimic并激活SIRT1后,线粒体膜电位水平回升。相反,转染miR-141-3p inhibitor后,线粒体膜电位增加。转染miR-141-3p inhibitor并抑制SIRT1后,线粒体膜电位水平降低。Western blot检测α-syn以及Nos1的表达水平发现,转染miR-141-3p mimic上调α-syn以及Nos1的表达量,SIRT1过表达可部分消除miR-141-3p的影响,下调α-syn以及Nos1的表达量。结论:在帕金森细胞模型中,SIRT1表达下调,miR-141-3p表达上调。miR-141-3p以SIRT1为直接作用靶基因,激活细胞中NF-κB信号通路,调控细胞的凋亡水平,ROS含量水平以及线粒体膜电位水平,影响帕金森病的发展。