论文部分内容阅读
自1981年6月首例由HIV引起的获得性免疫缺陷综合症（AIDS）被美国疾病控制中心确认以来，AIDS严重威胁着人类的生存与健康。本文以食用菇类为研究对象，围绕其中多效抗HIV-1活性组分的分离纯化、结构鉴定和生物活性进行研究。
已有研究显示氧化应激与艾滋病间存在着密切的关系。因此本研究首先以抑制红细胞溶血实验作为抗氧化活性筛选的指标，测定了九种不同的食用菇类，从中筛选确定蛹虫草为实验对象，并以其子实体为实验材料进行深入的研究。蛹虫草子实体经水提醇沉后，上清液命名为L，沉淀命名为C。利用大孔吸附树脂从L中分离得到四个组分（L1，L2，L3和L4），其中L3抗氧化活性最强：进一步通过高效液相色谱技术从L3中分离出三种抗氧化活性物质--f1，f2和f3。对这三种物质的质谱数据分析，推断其可能的化学结构分别为：f1，腺苷（分子式为：C10H13N5O4）；f2，异黄酮（分子式为：C20H20O7）；f3，二甲基鸟苷（分子式为：C12H17 N5O5）；样品C经DEAE-cellulose离子交换得到活性组分CD，再经Sephadex-75凝胶分离得到一个大分子抗氧化活性组分--CDS1。初步推测CDS1可能为含有鞣质、糖和蛋白质的聚合物。体外抗氧化活性实验结果表明，f1，f2和f3浓度为250μg/ml时，对红细胞溶血的抑制率均大于90％。同时，样品f1、f2、f3和CDS1作用于红细胞，可以提高红细胞中SOD酶的活性。
抗HIV-1活性的研究从抑制HIV-1蛋白酶（PR）和HIV-1逆转录酶（RT）两方面进行。针对目前HIV-1 PR抑制剂筛选方法中存在的操作复杂，价格昂贵等问题，本文利用HIV-1 PR对其外源表达宿主具有毒性作用的原理，构建了以大肠杆菌为宿主，pET28a为载体的HIV-1 PR抑制剂筛选体系。通过监测大肠杆菌表达HIV-1蛋白酶时的生长情况来评价样品对HIV-1蛋白酶活性的抑制作用。该体系以大肠杆菌为宿主，使用酶标仪采集数据不仅简化了操作流程，而且提高了安全性能，降低了实验成本。同时，结合非放射性逆转录酶ELISA方法对蛹虫草中抗氧化活性组分的抗HIV-1 PR和HIV-1 RT活性进行了评价。测试结果表明：L，L3，f1和f2对HIV-1 PR均具有抑制作用，其中f1活性最高，浓度为70μg/ml时比L3增高了约31％；C，CD，CDS1对HIV-1 R工具有一定的抑制作用。
在对HIV-1感染者的治疗中，细胞免疫功能的恢复作为免疫重建的重要组成部分日益受到重视，而细胞因子又是衡量细胞免疫功能的主要指标。因此，本文研究了活性样品L3和CD对小鼠体内细胞因子表达的影响。首先，以腹腔注射的方式对小鼠分别给药；接着采用SYBR Green为荧光染料的实时定量PCR方法，研究活性样品对小鼠脾脏细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γmRNA表达量的影响。实验结果表明，给药小鼠体内IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ四种细胞因子的mRNA表达水平有显著变化，其中活性样品L3和CD对小鼠的IL-2和IFN-γ基因表达水平均显示出不同程度的上调作用；而对IL-6和IL-10则均表现为不同程度的下调。这种调节有利于平衡AIDS患者体内相应细胞因子的变化，从而提高机体免疫力。
本研究从抗氧化活性、抑制HIV-1关键酶活和免疫调节三方面对蛹虫草中的活性成分进行了测定。为多效抗HIV药物的开发奠定了理论基础，同时也有很好的应用前景。