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第一部分：RCAN1.4调控区及编码区罕见遗传变异与中国汉族人群先天性心脏病的关联研究 目的：先天性心脏病（CHD）是出生缺陷相关死亡的主要原因，发病率为每100例活产约1例。CHD是婴幼儿死于出生缺陷的最主要原因，而其病因及发病机制不清。钙调磷酸酶调节因子1（RCAN1）基因编码钙调磷酸酶/ NFAT信号通路的调节蛋白，其对心内膜垫及心脏瓣膜发育起重要作用。为了探讨并解决中国人群中RCAN1与CHD易感性是否存在关联，同时解决上述相关问题，本研究提出如下科学假设：（1）RCAN1.4可能是心脏发育相关重要转录调控因子参与心脏发育。（2）RCAN1.4调控区或编码区罕见功能性变异位点与CHD的发生相关。 方法：（1）首先通过查阅已经报道的文献和原位杂交方法确定RCAN1在早期胚胎的表达谱。（2）通过对来自汉族人群靶向捕获测序数据中得到的RCAN1基因组中的变异位点与CHD进行关联分析。将得到的阳性位点在870名CHD患者和1320名对照的血液样品进行进一步的一代测序验证分析。并对阳性位点所在的部分心脏组织样本使用 qPCR检测突变对源性表达的影响，进一步用斑马鱼模式动物体内实验模拟突变的功能影响；此外，用双荧光素酶报告基因实验和电泳迁移率实验（EMSA）进行体外分子实验进行功能验证，以期揭示功能性突变位点导致CHD的发生的具体机制。 结果：（1）前人报道在小鼠和爪蛙的原位杂交结果中可以看到RCAN1在早期心脏发育过程在心脏高表达。由于RCAN1有2个常见的转录本，只相差一个外显子（29个氨基酸）在原位杂交的探针中是无法区分开的，因此，我们的WB结果显示RCAN1.4在E10.5天心脏发育关键时期也在心脏高表达明显高于同时期的大脑组织。（2） RCAN1.4转录物启动子区中的SNP（rs2243890A> G）与CHD的发生显著相关（P=0.007,**）。携带G等位基因的个体与携带A等位基因的个体相比，发生先心病的风险增加了1.66倍（OR值1.66;95％可信区间，1.30-2.11;P=4.68E-05）。在人心脏组织中，实时荧光定量PCR结果显示包含rs2243890A> G SNP的次要等位基因G样本与主要等位基因A样本相比RCAN1.4mRNA水平明显低3倍（P<0.01,**）。双荧光素酶报告基因测定结果显示包含G次要等位基因的启动子活性也明显低于 A主要等位基因（P<0.01）。电泳迁移率实验(EMSA)结果表明rs2243890 G等位基因对某些核蛋白具有较高的结合亲和力。此外，我们在VSD患者中鉴定出RCAN1.4编码区罕见的突变位点，p.E25K，并在斑马鱼模型中证明RCAN1.4E25K挽救效果（0.5%）低于RCAN1.4 野生型 mRNA的注射结果（23.1%）。体外荧光素酶报告基因系统在293T细胞也得到相同的结果：突变型质粒转染后与野生型相比对NFAT报告基因的反应明显降低（P<0.001,***）。 结论：（1）RCAN1.4是心脏发育过程中特异性表达的转录本。（2） RCAN1.4调控区即启动子区SNP位点显著下调其转录活性影响mRNA转录；进而影响蛋白质的功能引起心脏发育关键信号转导异常最终导致CHD的发生；编码区罕见变异位点破坏其重要功能结构域，影响蛋白质功能进而影响下游信号通路传导。 综合其表达谱与这2个位点的功能实验我们得出结论RCAN1.4缺陷可能增加汉族人群先心病风险，为 CHD病因学研究提供新的见解。 第二部分：VPS50基因与先天性心脏病的相关性研究 目的：在影响心脏发育的各种环境因素中，叶酸的利用率是一个重要元素。已经有流行病学研究报道，孕早期补服叶酸能显著降低先天性心脏病的发病率。对前人研究叶酸通路相关基因的突变位点进行的关联分析的结果进行再分析，得到的引起人类CHD的风险因子结果是不一致的，同时发现补服叶酸也不能完全预防CHD的发生。此外，其它微量元素，如铁元素的缺乏或过量，也会对循环系统的发育造成严重的影响。在小鼠中将转铁蛋白受体敲除，小鼠在胚胎发育的10.5天便会死亡，同时伴有心脏的发育异常。无论叶酸还是铁元素的转运与细胞利用过程均需要细胞内吞作用的介导和受体再循环过程。内体相关循环蛋白复合体(EARP)参与内吞再循环过程，其中 VPS50（又名CCDC132）蛋白是四个组成成分之一。由于在唐氏综合症中CHD发生率高达50%，而我们在8例流产胎儿左心室组组样品中检测到一半的品有VPS50与RCAN1的共表达情况，与CHD的发生率一致。因此我们提出提出科学假设，RCAN1低表达的同时 VPS50低表达的样品可能为DS合并CHD的样品，即VPS50的低表达与CHD的发生相关。 方法：构建探针用原位杂交的方法检测Vps50在小鼠胚胎发育过程中的表达情况。利用PiggyBac转座子破坏Vps50后，胚胎发育的形态检测。使用CRISPER-CAS9系统构建VPS50敲除细胞模型，用WB检测VPS50蛋白缺失后相应改变RCAN1，CaNA，Ubiquitin，K63和K48的表达。 结果：成功构建 Vps50正义反义探针并用原位杂交的方法检测Vps50在小鼠胚胎大脑神经管和心脏及心室原位表达。PiggyBac转座子破坏Vps50后小鼠在胚胎发育的12.5天死亡，同时表现出生长迟缓，心包膨大，神经管畸形等表型。在CRISPER-CAS9系统构建VPS50敲除Hela细胞模型中，用WB检测到VPS50敲除调控了细胞整体泛素化水平使整体泛素化水平升高，特别是K48升高。 结论：Vps50在小鼠心脏表达，当Vps50被PB转座子破坏掉后胚胎表现为心脏及神经管的发育异常。Vps50是一个参与胞吞运输的重要蛋白分子，因此它的功能在心脏及神经管早期发育过程中起关键作用。另一方面从细胞分子实验的结果来推断VPS50还有可能是通过调控了整体泛素水平或K48水平进而导致相关通路异常引发心脏发育的异常结果。