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研究背景和目的生物昼夜节律指的是机体的生命活动按照接近24小时为周期规律地发生震荡性变化。在哺乳动物中体温、激素分泌、睡眠与觉醒、静息与活动等生理现象和行为都具有典型的昼夜节律性。生物昼夜节律让生命体整体形成与外界环境相适应的节律,使机体更加合理高效地利用有限的资源和能量,维持所有生命活动正常进行。然而,这种机体与外界环境的同步性如果长期被干·扰,会给机体带来许多不良后果,甚至与内分泌紊乱、能量代谢失衡、肿瘤的发生和情绪调节障碍有着密切的关系。生物昼夜节律的调控主要依赖位于下丘脑的视交叉上核(SCN)。它是哺乳动物控制生物钟的主要脑区,又被称为中枢昼夜节律起搏器。它从视网膜接受光信号,通过该核团细胞中一种被称为分子生物钟的反馈调节机制影响细胞中各种钟控基因的转录出现昼夜节律,利用神经递质和激素等信号将节律信号传达给全身各个器官和组织,以达到中枢和外周组织的节律同步。分子生物钟由核心生物钟蛋白CLOCK、BMAL1、PER和CRY组成的反馈环调控。环境中影响生物钟的因素被称为授时因子,除了光照以外,还有社会授时因子。随着现代社会的发展,人们生活方式的改变,自然界的授时因子对人类生物节律影响越来越小,取而代之的是社会授时因子,其中最主要的就是进食节律。社会授时因子的紊乱同样会导致生物节律的失调,从而引发易感人群出现代谢紊乱和情绪调节障碍。在调查中人们发现不良生活方式导致的社会授时因子节律紊乱现象在人群中十分普遍,然而,进食行为的节律对生物节律所造成的影响却常常为人们所忽略,它与各种疾病之间的关系也未能引起人们的重视。有研究发现,改变正常的进食节律会影响能量代谢相关的信号通路,其中包括AMPK,CREB,和AKT等信号通路,扰乱机体能量代谢平衡,而这又与肥胖和糖尿病等代谢性疾病的发生有着密切关系。还有研究发现,只按照自然形成的进食规律来限制进食时间段,可以预防高脂饮食导致的代谢性疾病,减少心血管意外的发生。可见,进食节律可以加强外周节律震荡器与中枢节律起搏器之间的同步性,对机体能量代谢平衡有着重要意义。虽然目前已有一些针对进食节律与代谢紊乱、心血管疾病和亨廷顿病之间的研究,但是还未有关于进食节律和抑郁症之间具体联系的文献报道。目前一种通过巩固和调整患者昼夜节律来治疗抑郁症的方法,在临床试验中获得了意想不到的疗效。这种疗法被称作人际社会节律疗法(interpersonal social rhythms therapy,IPSRT),它要求患者根据作息时间表,形成更稳固的社会生活习惯,结果证明这种疗法对抑郁症患者起到了很好的效果。但是这种调控昼夜节律抗抑郁的机制目前并不清楚。小鼠是群居哺乳动物,正常情况下个体间存在复杂的社会互动,是一种用来研究断奶后孤养等社会应激的重要模式生物。目前有一些研究发现断奶后孤养会导致小鼠体重增加、出现焦虑和抑郁样行为和学习记忆能力下降等表现,还发现小鼠体内激素分泌节律紊乱。于是,我们为了进一步研究昼夜节律紊乱、社会隔离和抑郁症之间的关系,选用了青少年时期断奶后孤养小鼠模型来进行实验。我们的研究旨在探讨进食节律对断奶后孤养导致的体重改变和异常行为的影响,探索昼夜节律与抑郁症之间的关系,为理解抑郁症的发病机制,寻找新的预防和治疗抑郁症的方法提供理论基础。实验方法为了探讨限制进食时间对青少年期断奶后孤养小鼠的影响,我们设计了如下实验。(1)我们将4周龄小鼠随机分成对照组(Control)、自由饮食断奶后孤养组(SI+FA)和限制进食时间断奶后孤养组(SI+FT)。SI+FA组和SI+FT组均进行断奶后孤养处理4周,SI+FT组在断奶后孤养的同时被限制进食时间,即在光照时间段(08:00～20:00)禁食。在此期间于每周的同一时间测量三组小鼠的白天进食量、全天进食量和体重,以计算随着断奶后孤养的进行小鼠白天进食比例、全天能量摄入量和体重的变化。(2)4周处理后,对三组小鼠进行行为学检测,分别是旷场实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验和Morris水迷宫实验,以检测小鼠运动能力、焦虑样行为、抑郁样行为和学习记忆能力。⑶为了探究断奶后孤养影响动物行为的潜在机制,我们利用RT-qPCR的方法检测了下丘脑中Clock、Bmal1、Perl、Per2、Cryl和PPARγ基因的mRNA节律。利用Western blot和RT-QPCR技术检测了杏仁核MAOA和PPARγ的表达情况。(4)利用荧光素酶报告基因系统,探索PPARγ和BMAL1/NPAS2对MAOA启动子的作用。实验结果(1)我们发现断奶后孤养能够导致小鼠进食行为节律性减弱,断奶后孤养1周后,SI+FA组小鼠白天进食比例较Control组就开始出现明显增加;SI+FA组较Control组在第4周时出现体重增加,而限制进食时间能够减少断奶后孤养导致的小鼠体重增加,且全天能量摄入量在三组之间没有显著差异。(2)在行为学检测中,旷场实验显示,SI+FA组在5min内运动总路程较Control组明显增加,且5min内中央区停留时间SI+FA组较Control组没有明显差异,但是有减少的趋势。在高架十字迷宫实验中,SI+FA组小鼠在开臂停留时间明显低于Control组。限制进食时间的SI+FT组小鼠在旷场5min内运动总距离和中央区停留时间,以及高架十字迷宫开臂停留时间均较SI+FA组没有差异。旷场中30min运动总距离三组间没有显著差异。在强迫游泳实验中,SI+FA组的不动时间较Control组明显升高,而限制进食组SI+FT组小鼠不动时间较SI+FA组明显下降,并与Control组对比没有明显差异。在糖水偏好实验中,三组的糖水偏好率虽然没有明显差异,但SI+FA组的糖水偏好率较Control组有升高趋势,限制进食的SI+FT组较SI+FA组没有明显变化。在Morris水迷宫实验中,三组小鼠的游泳速度没有明显差异,在寻找水下平台的获得性训练过程中,潜伏期的变化曲线提示断奶后孤养自由进食的SI+FA组找到平台所需要的时间较Control组有延长的趋势,而限制进食时间的SI+FT组较SI+FA组能够更快找到平台;在最后一天的探查训练中,SI+FA组小鼠穿越原平台位置的次数较Control组明显减少,而SI+FT组小鼠穿越原平台位置次数较SI+FA组明显增加,并与Control组对比没有明显差异。(3)RT-QPCR结果显示下丘脑中Clock和Bmal1基因的表达水平在三组间没有明显差异,而Per1、Per2和Cry1的表达在SI+FA组较Control组出现了节律性减弱的现象,限制进食的SI+FT组以上基因的转录节律较SI+FA组没有明显差异;PPARγ在下丘脑中的转录水平存在明显节律,SI+FA组PPARγ mRNA节律性明显减弱,在ZT12和ZT18时SI+FA组的表达量明显低于Control组;而限制进食时间能够部分恢复PPARγ mRNA的节律,在ZT12时SI+FT组其表达量明显高于SI+FA组,且基本形态接近Control组。(4)罗格列酮能够降低pGL3-Maoa promoter的荧光素酶活性,pGL3-Maoa promoter与PPARy表达质粒共转细胞,荧光素酶活性也出现下降,pGL3-Maoa promoter与BMAL1和NPAS2表达质粒共转组荧光素酶活性较对照组显著升高,而在此基础上加入PPARγ表达质粒,结果荧光素酶活性会出现降低。结论从以上实验结果,我们可以得出以下结论,断奶后孤养可以导致小鼠进食行为的节律性减弱,体重增加和行为异常。限制进食时间处理能够预防断奶后孤养导致的小鼠体重增加,缓解抑郁样行为和学习记忆功能损害。断奶后孤养还能改变下丘脑中Ppary和核心生物钟基因Per1、Per2和Cry1的转录节律,以上改变只有Ppary能够被限制进食时间逆转。限制进食时间能够改变断奶后孤养小鼠杏仁核中MAOA和PPARγ的表达节律。PPARγ还可以抑制BMAL1/NPAS2对MAOA启动子的激活作用。