海马齿全长cDNA文库构建及耐盐相关基因的克隆

• 作 者: 郑善清
• 出 处: 海南大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 海马齿 全长cDNA文库 转录组 甜菜碱脱氢酶基因 半定量PCR

海马齿主要分布于热带和亚热带海岸的沙滩上,国内外学者研究证实海马齿具有良好的盐环境适应性,且在海水和淡水环境中均能良好生长,是一种研究植物耐盐和克隆耐盐相关基因的理想材料。本研究构建了海马齿全长cDNA文库,并采用最新发展的Solexa测序技术,对盐胁迫和非盐胁迫条件下生长的海马齿,进行高通量的转录组差异表达分析,获得差异表达的tag序列,然后从cDNA文库中分离差异全长基因。本研究构建的盐胁迫下海马齿的全长cDNA文库：用改良CTAB法提取总RNA,,SMART法反转录成cDNA, LD-PCR方法合成双链cDNA。LD-PCR产物经蛋白酶K消化和sfi 1酶切后,经CHROMA SPIN+TE-1000分离柱子除去小片段DNA后,回收0.5kb以上的片段,按照适当的比例连接λTripIEx2载体。连接产物利用MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts进行体外包装,’得到海马齿初级cDNA文库。初始文库的独立克隆数为2.4×106 pfu,初级文库滴度大于4.80×106pfu/mL,重组率为93.75%,插入片段在0.5-5 kb之间,扩增文库的滴度为1.21×109pfu/mL,所得文库质量较高。经Solexa高通量测序技术,获得了盐胁迫和非盐胁迫条件下海马齿的差异表达的tag序列,其中淡水和海水处理的海马齿转录组中,分别分析了763911和2073628个16bp长的序列,获得了海水处理苗的转录组中993662个标签,淡水处理苗的转录组中450349个标签,海水处理苗种特异表达的标签有158921,淡水处理苗中特异表达的标签有3038个,并得到226个在两转录组中表达量有显著差异的标签。依据转录组分析得到的标签子以及已发表的耐盐基因的序列信息,本研究在全长cDNA文库中克隆得到了甜菜碱脱氢酶基因BADH,该BADH基因共有1503个碱基,可编码500个氨基酸,编码的多肽理论分子量为54.53 kDa,理论等电点为pI：5.22,海马齿BADH基因与千穗谷、盐爪爪、滨藜、菠菜和麦冬的BADH基因进行同源性分析显示,其同源性都达到80%以上,并经初步验证,推测该基因的表达可能与海马齿的耐盐机理有关。本研究得到的海马齿全长cDNA文库和转录组差异表达标签,是研究海马齿耐盐机理的丰富资源,在此基础上,可以通过分析差异表达标签和利用已有耐盐基因的信息,继续克隆海马齿中耐盐相关基因、功能验证等后续研究,并利用基因工程操作,获得转基因抗盐植物,以适应并改良日益严重的土壤盐渍化现状。