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第一部分：大鼠角膜缘基质微环境细胞可支持大鼠口腔黏膜上皮细胞的生长并改变其生物学性状
目的：自体口腔黏膜上皮细胞移植（Autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation，COMET）是治疗角膜缘干细胞缺乏的重要方法，但是COMET术后周边部角膜新生血管的出现阻碍了其广泛地应用于临床。本研究将同种异体角膜缘基质微环境细胞（Limbal niche cells, LNCs）代替传统的小鼠源性的3T3细胞作为滋养细胞来培养口腔黏膜上皮细胞，从而降低口腔黏膜上皮细胞诱导新生血管生成的可能性。
方法：将大鼠口腔黏膜上皮细胞与LNCs或3T3细胞共培养。对体外培养得到的口腔黏膜上皮细胞进行H&E染色及细胞免疫化学检测。通过RT-qPCR和Western Blotting分别在转录和翻译水平检测并比较各组口腔黏膜上皮细胞中血管生成相关因子的表达量。随后提取不同培养体系中上皮细胞培养基上清（条件培养基）对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）进行刺激，通过检测接受了不同刺激的 HUVECs 的细胞活性及管腔形成情况进而再次比较不同培养体系所得到的口腔黏膜上皮细胞诱导新生血管产生的潜能。
结果：无论选择LNCs还是3T3细胞作为滋养层，均可成功地在体外扩增培养出口腔黏膜上皮细胞。细胞免疫化学结果显示体外扩增得到的各组口腔黏膜上皮细胞中p63α，ABCG2，Ki67和CK3阳性细胞比例无明显差异。RT-qPCR和Western Blotting结果分别从基因和蛋白水平证明，与3T3组相比，LNC组所得到的口腔黏膜上皮细胞表达较少的bFGF和较多的PEDF和sFlt-1。此外，与3T3组相比，LNC组的口腔黏膜上皮细胞可降低HUVECs的细胞活性和形成管腔的能力。
结论：LNCs可以代替3T3细胞作为体外扩增口腔黏膜上皮细胞的滋养细胞。以LNCs作为滋养细胞培养的口腔黏膜上皮细胞比传统方法培养的口腔黏膜上皮细胞具有较小的诱发新生血管的可能性。本研究为口腔黏膜上皮细胞培养体系的优化和COMET的更广泛的应用提供了实验基础。
第二部分：角膜缘基质微环境细胞对口腔黏膜上皮细胞移植后新生血管生成影响的动物实验研究
目的：当发生严重的双眼角膜缘干细胞缺乏（Limbal stem cell deficiency，LSCD）时眼表的重建是当务之急，自体口腔黏膜上皮细胞移植（Autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation，COMET）为眼表重建策略之一，它不受供体来源不足和长期进行免疫抑制治疗的限制。我们之前将角膜缘基质微环境细胞（Limbal niche cells，LNCs）作为滋养细胞建立的口腔黏膜上皮细胞（Oral mucosal epithelial cells， OMECs）体外培养体系显示出具有抑制术后周边角膜新生血管的潜能，本研究试图在动物模型中进一步验证这一作用。
方法：建立日本大耳白兔LSCD模型，通过裂隙灯检查及H&E染色检验该模型建立是否成功。将OMECs悬液种植到去上皮羊膜上，并与LNCs或3T3细胞共培养。将培养的口腔黏膜上皮细胞片移植于模型眼(COMET-LNCs组或COMET-3T3组)，通过裂隙灯检查及免疫化学染色检比较各组眼表重建情况。通过 RT-qPCR 和 Western Blotting比较各组角膜血管生成相关因子的表达情况。
结果：造模后，模型眼出现角膜混浊、结膜化及新生血管化，且无恢复或减轻的倾向。各组动物在接受COMET后，眼表情况基本恢复透明，但是在COMET-3T3组的一个角膜发现轻度的新生血管形成，且COMET-3T3组角膜中可检测到CD34。与COMET-3T3组角膜相比，COMET-LNCs组的角膜表达高水平的PEDF和sFlt-1，但bFGF表达水平较低。
结论：在动物实验中，以 LNCs 作为滋养细胞培养的口腔黏膜上皮细胞片可用于COMET手术，治疗效果肯定。而且具有比传统方式（以3T3细胞作为滋养细胞培养OMECs）更小的诱发术后新生血管的风险。
目的：自体口腔黏膜上皮细胞移植（Autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation，COMET）是治疗角膜缘干细胞缺乏的重要方法，但是COMET术后周边部角膜新生血管的出现阻碍了其广泛地应用于临床。本研究将同种异体角膜缘基质微环境细胞（Limbal niche cells, LNCs）代替传统的小鼠源性的3T3细胞作为滋养细胞来培养口腔黏膜上皮细胞，从而降低口腔黏膜上皮细胞诱导新生血管生成的可能性。
方法：将大鼠口腔黏膜上皮细胞与LNCs或3T3细胞共培养。对体外培养得到的口腔黏膜上皮细胞进行H&E染色及细胞免疫化学检测。通过RT-qPCR和Western Blotting分别在转录和翻译水平检测并比较各组口腔黏膜上皮细胞中血管生成相关因子的表达量。随后提取不同培养体系中上皮细胞培养基上清（条件培养基）对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）进行刺激，通过检测接受了不同刺激的 HUVECs 的细胞活性及管腔形成情况进而再次比较不同培养体系所得到的口腔黏膜上皮细胞诱导新生血管产生的潜能。
结果：无论选择LNCs还是3T3细胞作为滋养层，均可成功地在体外扩增培养出口腔黏膜上皮细胞。细胞免疫化学结果显示体外扩增得到的各组口腔黏膜上皮细胞中p63α，ABCG2，Ki67和CK3阳性细胞比例无明显差异。RT-qPCR和Western Blotting结果分别从基因和蛋白水平证明，与3T3组相比，LNC组所得到的口腔黏膜上皮细胞表达较少的bFGF和较多的PEDF和sFlt-1。此外，与3T3组相比，LNC组的口腔黏膜上皮细胞可降低HUVECs的细胞活性和形成管腔的能力。
结论：LNCs可以代替3T3细胞作为体外扩增口腔黏膜上皮细胞的滋养细胞。以LNCs作为滋养细胞培养的口腔黏膜上皮细胞比传统方法培养的口腔黏膜上皮细胞具有较小的诱发新生血管的可能性。本研究为口腔黏膜上皮细胞培养体系的优化和COMET的更广泛的应用提供了实验基础。
第二部分：角膜缘基质微环境细胞对口腔黏膜上皮细胞移植后新生血管生成影响的动物实验研究
目的：当发生严重的双眼角膜缘干细胞缺乏（Limbal stem cell deficiency，LSCD）时眼表的重建是当务之急，自体口腔黏膜上皮细胞移植（Autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation，COMET）为眼表重建策略之一，它不受供体来源不足和长期进行免疫抑制治疗的限制。我们之前将角膜缘基质微环境细胞（Limbal niche cells，LNCs）作为滋养细胞建立的口腔黏膜上皮细胞（Oral mucosal epithelial cells， OMECs）体外培养体系显示出具有抑制术后周边角膜新生血管的潜能，本研究试图在动物模型中进一步验证这一作用。
方法：建立日本大耳白兔LSCD模型，通过裂隙灯检查及H&E染色检验该模型建立是否成功。将OMECs悬液种植到去上皮羊膜上，并与LNCs或3T3细胞共培养。将培养的口腔黏膜上皮细胞片移植于模型眼(COMET-LNCs组或COMET-3T3组)，通过裂隙灯检查及免疫化学染色检比较各组眼表重建情况。通过 RT-qPCR 和 Western Blotting比较各组角膜血管生成相关因子的表达情况。
结果：造模后，模型眼出现角膜混浊、结膜化及新生血管化，且无恢复或减轻的倾向。各组动物在接受COMET后，眼表情况基本恢复透明，但是在COMET-3T3组的一个角膜发现轻度的新生血管形成，且COMET-3T3组角膜中可检测到CD34。与COMET-3T3组角膜相比，COMET-LNCs组的角膜表达高水平的PEDF和sFlt-1，但bFGF表达水平较低。
结论：在动物实验中，以 LNCs 作为滋养细胞培养的口腔黏膜上皮细胞片可用于COMET手术，治疗效果肯定。而且具有比传统方式（以3T3细胞作为滋养细胞培养OMECs）更小的诱发术后新生血管的风险。