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肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae）是继大肠杆菌后第二大条件致病菌,作为一种人兽共患病原菌,该菌广泛分布于土壤、皮肤、呼吸消化道和泌尿生殖道中,并可引起人和动物肺炎、腹膜炎、创伤性感染、败血症等疾病。近年来,临床多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌不断出现,严重威胁人和动物的健康,为此寻找新型抗感染药物和抗感染策略已迫在眉睫。肺炎克雷伯菌的致病性依赖于毒力因子,包括荚膜多糖、脂多糖、黏附蛋白和铁载体等。其中,荚膜多糖和脂多糖是细菌生物膜的主要成分。Ш型菌毛主要介导细菌对内皮细胞和上皮细胞的黏附,而对宿主细胞的黏附是肺炎克雷伯菌入侵机体并引发感染的首要条件。细菌群体感应（Quorum sensing,QS）系统能调控生物发光、生物膜形成、毒力基因表达、细胞分化等多种生理功能。LuxS/AI-2型QS系统广泛存在于G+和G-中,同时具有种内信号和种间信号双重功能,作用范围更广。丁香酚（Eugenol）是丁香、樟脑、肉桂等植物挥发油的主要成分,具有抑菌、防腐、抗炎、抗氧化、镇痛麻醉等多种药理作用。随着对天然化合物研究的不断深入,研究人员发现亚抑菌浓度的丁香酚还具有QS系统抑制活性,为预防和治疗细菌感染提供了新的思路。本研究从临床发病猪鼻拭子中分离了2株肺炎克雷伯菌,通过形态观察、培养特性、生化试验、分子生物学鉴定、药敏试验、小鼠致病性等试验,鉴定这2个分离株均为多重耐药肺炎克雷伯菌,并分别命名为KP1株和KP2株。其中,KP1株对小鼠的致病性略强于KP2株,二株菌的LD50分别为5×108cfu/mL,1×109cfu/mL;通过刚果红平板、结晶紫染色、拉丝试验、主要毒力基因PCR方法等对KP1株和KP2株的毒力表型进一步鉴定,结果显示,KP1株和KP2株都能在刚果红平板上长出黑色菌落,结晶紫染色表明二者能够形成生物膜,KP2株生物膜形成能力强于KP1株。KP1株和KP2株均不具有高黏表型,且rmpA基因呈阴性,排除高毒力菌株的可能。荚膜血清型鉴定结果显示,KP1株属于K2荚膜血清型。为了进一步研究亚抑菌浓度的丁香酚对肺炎克雷伯菌AI-2信号分子和菌毛黏附素MrkD蛋白的影响,本研究采用微量二倍稀释法测定了丁香酚对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。结果显示,丁香酚对KP1株和KP2株的MIC和MBC相同,均为2μg/mL,最小抑膜浓度（MBIC）为1μg/mL,表明其具有良好的抑菌活性。采用1/4MIC丁香酚与KP1株共培养后感染小鼠,结果发现,亚抑菌浓度的丁香酚能够延长肺炎克雷伯菌感染小鼠的中位存活时间。但心血菌落计数结果和病理切片观察显示,丁香酚处理组相比对照组缓解小鼠感染的差异不显著。此外,本试验采用原核转录组测序技术研究亚抑菌浓度丁香酚对AI-2合成主要调节基因luxS、pfs（mtnn）、lsrR、lsrK和菌毛黏附素mrkD基因在转录水平的影响,并通过实时荧光定量方法对转录组测序结果进行验证,结果显示亚抑菌浓度丁香酚处理组luxS、lsrR和mrkD基因的FPKM值低于对照组,pfs和lsrK基因的FPKM值高于对照组。qPCR验证结果显示,亚抑菌浓度丁香酚可使luxS和mrkD基因表达下调,使pfs（mtnn）、lsrR、lsrK基因表达上调,lsrR、lsrK基因表达量均显著高于对照组。lsrR基因验证结果与转录组测序结果存在差异,结合其FPKM值高于lsrK基因且log2（FC）值较高,推测尽管丁香酚使lsrR和lsrK基因表达均上调,但lsrR基因表达量更高,总体表现为转录抑制,从而抑制AI-2转运。为了证明LuxS/AI-2型QS系统对肺炎克雷伯菌KP1株生长特性、生物膜、以及毒力的影响,本实验成功构建了pRE112-luxS上下游同源臂重组自杀质粒,采用同源重组方法构建了KP1ΔluxS基因缺失株。结果显示,KP1ΔluxS株与野生株相比生长速度无明显变化,但生物膜形成能力和毒力均减弱,表明luxS基因能调控细菌的生物膜和毒力。为了研究亚抑菌浓度丁香酚对LuxS、Pfs和MrkD蛋白的体外抑制活性,本研究分别扩增这3个蛋白的编码基因,经测序酶切鉴定正确后与原核表达载体pET-28a（+）进行连接构建重组原核表达质粒。利用IPTG诱导表达,亲和层析Ni+柱纯化表达产物,SDS-PAGE电泳Western-blot对表达产物进行分析。结果显示,分别获得了大小约为24kDa的LuxS、30kDa的Pfs和35kDa的MrkD。Western-blot结果表明,亚抑菌浓度丁香酚能够促进LuxS蛋白表达、抑制Pfs蛋白表达,1/8MIC和1/4MIC抑制MrkD的表达。AI-2体外合成试验结果表明丁香酚能够抑制AI-2分子的合成且呈浓度依赖。分子对接预测发现,丁香酚与LuxS、Pfs蛋白对接较好,通过分子间作用力改变其构象,但与MrkD叠合不理想。上皮细胞黏附和黏附抑制试验结果显示,MrkD蛋白能够浓度依赖地促进肺炎克雷伯菌对MDBK细胞的黏附,而丁香酚能够抑制肺炎克雷伯菌的黏附作用,该抑制作用同样随丁香酚浓度的升高而增强。