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人表皮生长因子是由53个氨基酸残基组成的分子量约为6 KDa的单一多肽链,具有促进上皮细胞生长分化,修复受损粘膜,形成角质层保护皮肤等作用,具有极大的应用价值。由于来源少,精制与纯化成本高,无法满足需求。本研究通过优化信号肽序列及基因剂量,共表达分子伴侣PDI与转录因子Aft1、Hac1p,以期提高人表皮生长因子在毕赤酵母中的分泌表达水平,得到高效表达人表皮生长因子的毕赤酵母基因工程菌株。（1）根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性,优化信号肽并将优化的序列Nα插入p PICZαA中,获得重组载体p PICZ-Nα。以p PICZ-Nα和p PICZα-rhEGF为模板,获得片段Nα和rhEGF。通过SOE-PCR构建重组片段Nα-rhEGF,并插入p PICZαA中获得p PICZ-Nα-rhEGF。将重组载体转移至巴斯德毕赤酵母KM71基因组中,得到表达菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF和KM71-p PICZ-Nα-rhEGF。菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF、KM71-p PICZ-Nα-rhEGF经摇瓶诱导发酵96h,取上清进行检测,结果表明KM71-p PICZ-α-rhEGF胞外分泌总蛋白、活性分别达到93.2675±13.4678 mg/L、96065±5609 IU/m L,KM71-p PICZ-Nα-rh EG F胞外分泌总蛋白、活性分别达到134.5165±17.7482 mg/L、141242±18128 IU/m L,相比菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF分别提高了44.22%和47.02%。（2）利用内切酶BglⅡ和Bam HⅠ互为同尾酶,以p PICZ-Nα-rhEGF为基础,分别构建含2、3、4、5拷贝数人表皮生长因子表达框的重组质粒p PICZ-2Nα-rhEGF、p PICZ-3Nα-rhEGF、p PICZ-4Nα-rhEGF、p PICZ-5Nα-rhEGF,并连接His4片段。将线性化后的重组质粒p PICZ-2Nα-rhEGF-His4、p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、p PICZ-3Nα-rhEGF-His4和p PICZ-5Nα-rhEGF-His4电转化至毕赤酵母KM71菌株,在含Zeocin抗生素（100μg/m L）的YPDS平板进行筛选,重组子用荧光定量PCR进行鉴定,得到分别含2、3、4、5拷贝人表皮生长因子表达框的毕赤酵母重组菌株表达菌株KM71-p PICZ-2Nα-rhEGF-His4、K M71-p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4。将含1、2、3、4、5拷贝人表皮生长因子表达框的重组菌株经摇瓶诱导发酵96 h,取发酵上清液进行检测。菌株KM71-p PICZ-Nα-rhEGF、KM71-p PIC Z-2Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4胞外分泌总蛋白产量分别为134.5165±17.7482 mg/L;143.9850±17.862 mg/L、169.6153±17.6628 mg/L、237.6390±23.6773 mg/L、127.3843±15.6234 mg/L,发酵液上清总活性分别为137040±25124IU/m L、153344±23105 IU/m L、175551±19862 IU/m L、235052±23398 IU/m L和1118467±24170 IU/m L。四拷贝菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4胞外蛋白总量与活性最高,较一拷贝表达菌株KM71-p PICZ-Nα-rhEGF,其胞外蛋白含量和最终胞外蛋白含量分别提高了81.73%和71.52%。菌株KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4分别仅为四拷贝菌株的53.60%和50.40%。（3）提取菌株DH5α-p PICZ9K-PDI-G418、DH5α-p PICZ9K-Aft1-G418和DH5α-p PICZ9K-Hac1p-G418质粒后使用电转法,得到共表达菌株KM71-p PIC Z-4Nα-rhEGF-His4-PDI、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Aft1和KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Hac1p。共表达菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-PDI、KM71-p PICZ-4Nα-rh EG F-His4-Aft1、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Hac1p经小批量发酵96h后检测发酵液中胞外分泌总蛋白含量分别为227.4239±20.1687 mg/L、144.5416±20.0676 mg/L、171.006±24.3572 mg/L、309.0315±25.4678 mg/L;总活性分别为218554±27542 IU/m L、145987±24268 IU/m L、176136±25087 IU/m L、311812±22697 IU/m L。其中,共表达分子伴侣PDI与转录因子Aft1对分泌目标蛋白产生负面影响,共表达转录因子Hac1p对菌株分泌目标蛋白具有显著促进作用,相较于四拷贝菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4胞外蛋白含量和活性分别提升了35.88%和36.68%。（4）将共表达菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Hac1p于3 L发酵罐中进行高密度发酵,总发酵时长为96 h。当种子液进入发酵罐,每隔12 h记录一次OD600nm。当饥饿阶段结束,进入诱导阶段后每隔12 h测定一次胞外分泌总蛋白含量。最终,菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Hac1p的OD600nm达到240,发酵液中胞外分泌总蛋白含量为1.6 g/L。