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持续性非卧床腹膜透析(Continuous Ambulatory PeritonealDialysis，CAPD)是终末期肾病(End Stage Renal Disease，ESRD)患者的主要替代治疗之一。研究显示，透析相关性腹膜纤维化导致的超滤衰竭(Ultrafiltration Failure，UFF)已经逐渐成为CAPD患者退出的主要原因，极大地限制了腹膜透析的推广应用。研究腹膜纤维化的发病机制和防治手段已成为维持腹膜透析持续发展的关键。腹膜纤维化是一个多细胞因子参与的病理生理过程，目前研究认为转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)在腹膜纤维化过程中为启动和中枢作用，但由于其靶细胞种类繁多、效应复杂，完全阻断后果难以预料。而结缔组织生长因子(Connective TissueGrowth Factor，CTGF)作为TGF-β的下游因子，介导了TGF-β部分的促纤维化效应，且作用单一，被认为是可能比TGF-β更理想的抗腹膜纤维化的靶目标。我们前期的研究已经证实，以逆转录病毒载体介导的CTGF短发卡RNA (short hairpin RNA，shRNA)，可明显抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞内CTGF、血管内皮生长因子及细胞外基质的表达，对于腹膜纤维化具有潜在治疗价值。但目前仍缺少以CTGF为靶点的、将RNA干扰(RNA interference，RNAi)运用于腹膜纤维化动物模型的研究，同时逆转录病毒载体也存在随机插入宿主序列的安全隐患。因此，我们在进一步寻找更有效的基因治疗方法来抑制腹膜细胞CTGF的表达。近年来，聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM dendrimers)作为核酸、质粒的运载体系逐渐得到重视。PAMAM是一种非病毒纳米载体，具备无免疫原性、无遗传毒性、转染效率高、可长期稳定表达等优良特性，在DNA疫苗和基因治疗领域具有良好的应用前景。但目前尚未见PAMAM携带shRNA抑制促纤维化因子的研究报道。因此我们构建了一种表达CTGF-shRNA的质粒，通过PAMAM的介导，转染体外培养的小鼠腹膜间皮细胞和小鼠腹膜纤维化模型，观察其对腹膜间皮细胞和腹膜组织CTGF表达以及纤维化的影响。本文分为三部分，第一章构建表达CTGF-shRNA的pGenesil-1质粒，第二章应用PAMAM载体介导pCTGF-shRNA干扰原代培养的小鼠腹膜间皮细胞，第三章应用PAMAM载体介导pCTGF-shRNA干扰小鼠腹膜纤维化模型。本研究的目的、方法、结果、结论概述如下：目的：构建表达小鼠CTGF-shRNA的pGenesil-1质粒(pCTGF-shRNA)，通过PAMAM纳米载体介导，分别转染小鼠腹膜间皮细胞和小鼠腹膜纤维化模型，研究其对于腹膜间皮细胞和腹膜组织的CTGF、TGF-β1及FN表达的影响。方法：1．应用生物信息学方法，参考shRNA的设计策略，设计2条靶序列mCTGF1和mCTGF2以及一条阴性对照HK。分别与pGenesil-1质粒连接，构建相应的3个质粒pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA和pHK-shRNA，并通过酶切和测序等方法进行鉴定。检测PAMAM G9／DNA(质粒)复合物的物化特性。2．采用胰蛋白酶消化法从小鼠腹膜组织中分离腹膜间皮细胞进行体外培养，应用PAMAM G9将pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA和pHK-shRNA质粒分别转染高糖(4.25％葡萄糖)刺激下的第3代小鼠腹膜间皮细胞。采用逆转录多聚酶链式反应(ReverseTranscription-PCR，RT-PCR)半定量分析检测细胞CTGF、TGF-β1和FN基因的转录水平，采用Western Blot检测相应蛋白质的表达水平。3．将昆明小鼠随机分为转染组和对照组，分别经腹腔注射PAMAM G9／pHK-shRNA复合物或生理盐水，于24h、48h、96h和7d留取壁层和脏层腹膜组织，制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察壁层腹膜绿色荧光蛋白的表达情况，同时采用Western Blot检测脏层腹膜绿色荧光蛋白的表达。4．将C57BL／6小鼠随机分为CTGF干扰组、HK转染组、腹膜纤维化模型组和正常对照组4组，分别给予相应处理28天后，留取壁层和脏层腹膜组织。应用Masson染色检测壁层腹膜厚度，采用RT-PCR半定量分析检测各组腹膜组织CTGF、TGF-β1和FN基因的转录水平，采用Western Blot和免疫组化检测相应蛋白质的表达水平。结果：1．表达CTGF-shRNA的pGenesil-1质粒通过酶切鉴定无碱基缺失，测序证实无碱基突变，提示pCTGF-shRNA构建成功。PAMAM G9可保护结合的质粒分子不被限制性内切酶消化，提示PAMAM G9／DNA复合物性质稳定。2．高糖可刺激小鼠腹膜间皮细胞CTGF、TGF-β1及FN的mRNA和蛋白表达明显上调。PAMAM载体可介导pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA和pHK-shRNA转染原代培养的小鼠腹膜间皮细胞。pCTGF1-shRNA转染组和pCTGF2-shRNA转染组的CTGF和FN的表达较高糖组、pHK-shRNA转染组明显下调(P＜0.05)，尤其以pCTGF2-shRNA转染组下降显著。TGF-β1的表达在各组间无显著性差异。3．正常对照组小鼠的腹膜组织未能检测到绿色荧光蛋白的表达，而在PAMAM G9／pHK-shRNA转染组的各时间点(24h、48h、96h、7d)均可检测到绿色荧光蛋白的表达，其中以48h表达最强，显著高于其他各时间点(P＜0.01)。Western Blot检测结果与冰冻组织切片的结果一致。4．CTGF干扰组、HK转染组、纤维化模型组和正常对照组小鼠的平均腹膜厚度分别为(24.7±3.8)μm、(34.6±4.2)μm、(36.2±3.6)μm和(7.5±2.4)μm，CTGF干扰组与模型组、HK转染组相比均有显著性差异(P＜0.01)，但较正常对照组仍明显增厚(P＜0.01)。CTGF干扰组、HK转染组和腹膜纤维化模型组的腹膜组织CTGF、TGF-β1及FN的mRNA和蛋白表达均明显高于正常对照组(P＜0.05)；CTGF干扰组与模型组比较，CTGF、TGF-β1及FN的表达均明显下调(P＜0.05)；HK转染组与模型组比较，CTGF、TGF-β1及FN的表达均无统计学差异(P＞0.05)。结论：1．PAMAM载体可介导pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA转染原代培养的小鼠腹膜间皮细胞，并能抑制高糖诱导的CTGF和FN的表达上调，尤其以pCTGF2-shRNA作用更为明显，但对TGF-β1的表达无抑制作用。2．PAMAM载体可介导pCTGF2-shRNA转染小鼠腹膜纤维化模型，能降低腹膜组织CTGF、TGF-β1及FN的表达，减轻腹膜增厚和胶原沉积，提示PAMAM介导的pCTGF-shRNA可有效地用于腹膜纤维化的基因治疗。