论文部分内容阅读
铁元素是生物有机体必须的微量元素,铁缺乏会导致生物有机体正常的生长发育受到抑制,同时,铁在细胞内含量过高又会造成对有机体的氧化毒害。地球中铁的含量十分丰富,但是由于铁的化学特点,在正常条件下趋向于形成三价态铁[Fe(Ⅲ)]的形式,不利于植物吸收,因此全球范围内普遍存在植物铁缺乏的状况,并进一步造成食物链上级的动物及人类铁营养缺乏。植物已经适应了缺铁的环境条件,并在缺铁条件下启动高效吸收铁的机制。在高等的被子植物中,当环境铁缺乏时,非本科植物主要通过以还原根际Fe(Ⅲ)的策略从土壤中高效获得铁,被称为机理Ⅰ；而禾本科植物主要通过分泌酸性有机小分子,将土壤中的Fe(Ⅲ)螯合并活化,并吸收入体内,被称为机理Ⅱ。研究表明,机理Ⅰ和机理Ⅱ所涉及的诸多功能基因在非禾本科和禾本科植物中均存在,并且功能和蛋白同源性均比较保守,说明机理Ⅰ和机理Ⅱ在植物中并非截然区分的。由于高效铁吸收的诸多金属离子转运蛋白并非严格特异的,因此在植物启动对缺铁的响应时,同时需要维持体内诸多金属离子的稳态,以保证不因缺铁反应而造成体内金属离子过量的伤害。植物体内金属离子稳态的维护仍然需要复杂的信号转导调控机制,同时涉及诸多非特异性的金属离子转运机制,通过将包括铁在内的过量的金属离子分配到细胞壁、液泡等不容易造成伤害的区域,区隔化这些过量的金属离子同时起到储存的作用。最初,我们的研究兴趣集中在植物对干旱反应的分子遗传学基础。为此已经成功利用对温度敏感的远红外热成像系统,以叶片表面温度微小变化为监控指标,构建了有效的遗传学筛选体系,从而使我们可以鉴定多种与干旱有关的信号转导的突变体。激活标签(activation tagging)技术是以功能获得(gain-of function)突变体为研究对象,克服功能缺失(loss-of function)突变体由于功能冗余基因存在的限制,在植物功能基因组学的研究中具有重要的作用。我们从雌二醇诱导T-DNA突变体库(IGDB-XVE T-DNA collections)中筛选得到其中一个干旱反应的突变体(Doi2)。在干旱条件下,Doi2失水较快。但是更令人感兴趣的是,该突变体在雌二醇诱导下同时缺铁处理,表现为叶片失绿,表现出明显的缺Fe症状。通过TAIL-PCR (Thermal asymmetric interlaced-PCR)技术获得T-DNA插入的基因组旁邻序列,克隆了突变体的基因,它编码一个类似受体的蛋白激酶(Receptor-Like Kinase, RLK).通过生物信息学分析,DOI2编码一个299氨基酸的蛋白,该蛋白富含半胱氨酸残基,具有N段的信号肽和C端的单一跨膜域结构,同时,在其肽链中包含两个DUF26(domain of unknown function No.26)结构域,DUF26的功能目前为止还没有更明确的阐述。构建DOI2超表达突变体SP：：DOI2及鉴定DOI2功能缺失纯合突变体doi2,我们对D0I2超表达植株、功能缺失植株及野生型植株进行了深入地分析,同时与已发表的文献进行比较,确认了DOI2超表达在拟南芥Co10生态型中的表型,及D0I2超表达导致植株对缺铁环境敏感,而产生缺铁黄化的表型,该表型只与Fe缺乏有关,排除了其他因素的影响。同时,通过GUS组织表达分析及GFP荧光定位分析,发现D0I2的组织表达及细胞定位与其表型是相对应的,即DOI2在拟南芥幼苗根部的成熟区表达,同时在细胞内,可以通过其单一的跨膜区定位在细胞质膜上。由于众所周知的根际环境pH值对根际可利用Fe的浓度的影响,以及拟南芥作为机理Ⅰ植物在缺铁反应中启动质膜H+-ATPase酸化根际环境的功能,我们对DOI2与拟南芥质膜H+-ATPase——AtAHAs的关系进行了研究。首先,DOI2超表达导致的植株对根际缺铁的敏感性与根际pH有关,其次,DOI2超表达植株表现出在缺铁培养基中对根际酸化的能力有所减弱,这些间接证据暗示DOI2可影响到拟南芥缺铁反应中启动质膜H+-ATPase酸化根际的功能。进一步的研究发现,DOI2与拟南芥11个AtAHAs中的AtAHA3、AtAHA5、AtAHA6、AtAHA7、AtAHA9在酵母双杂交实验系统中表现出互作关系,其中与AHA7较强的互作关系尤为令我们感兴趣,因为AHA7已被证明在拟南芥缺铁反应中起着比较重要的作用。在与DOI2与AHA7互作的进一步研究中,我们发现DOI2与AHA7主要的互作区域在其肽链N侧的第一个DUF26结构域,这一信息为阐述DUF26结构域的功能提供了新的信息。通过实时定量PCR试验,我们对拟南芥缺铁反应有关的基因AtIRT1、AtFRO2、 AtAHA7、AtFIT1以及涉及缺铁反应中被诱导的金属离子转运至液泡的非特异性金属离子转运蛋白MTPc3的基因在DOI2超表达情况下的转录表达情况进行了分析。结果表明,DOI2超表达导致拟南芥野生型植株中可被强烈诱导的相关基因AtIRT1、AtFRO2的激活受到抑制,存在同样现象的还有AtAHA7、AtFIT1基因,这一结果强烈暗示DOI2对于拟南芥缺铁反应调控的机理在于参与了信号转导上游环节的负调控。这一结果受到我们另外实验的验证,即在DOI2超表达植株中,缺铁处理条件下根际还原力下降。将DOI2蛋白膜外区在大肠杆菌中原核表达并进行亲和层析纯化,对纯化的蛋白进行了初步的研究,结果发现纯化的蛋白可表现出单体、二聚体以及多聚体等相对稳定的状态,同时这些状态之间的比例与环境的氧化还原状态有关,在较高水平的还原状态下才表现为单体和二聚体占优势的形式,更令人感兴趣的是,在不同浓度的过渡金属离子处理下,DOI2蛋白的不同聚合状态表现出与铁离子浓度相关。结合生物信息学分析,DOI2蛋白的两个富含半胱氨酸残基的DUF26结构域共含有4个保守的半胱氨酸残基,可通过二硫桥形成对金属离子结合的位点,其同质二聚体的形式也是许多金属离子结合蛋白的特征。结合上述研究中证明的DOI2对缺铁反应调控的环节在其上游,DOI2很可能通过与其他配体或亚基形成复合物的形式,作为对铁状态的感受子影响下游基因表达。有关推论需要进一步的研究来确认。