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第一部分MiR-126介导Spred-1修复糖尿病内皮祖细胞功能损伤【目的】既往研究发现，糖尿病患者体内内皮祖细胞数量减少和细胞功能损伤导致其血管修复能力减弱，这是糖尿病血管病变和动脉粥样硬化的发生的重要原因。本研究通过筛选糖尿病患者EPCs内表达异常的microRNAs,明确相关microRNAs在糖尿病EPCs功能损伤中的作用。本部分根据筛选结果，先对miR-126进行研究，明确miR-126在调控EPCs修复血管损伤中的功能和作用。【方法】我们按性别、年龄、用药等基本情况匹配的原则，从的糖尿病患者和非糖尿病患者中分离两组患者的外周血单个核细胞，再使用CD133+磁珠分离EPCs。Microarray assay分析两组EPCs上microRNA表达谱的差异，并用实时定量Realtime-PCR方法检测糖尿病患者和非糖尿病患者EPCs上的microRNA表达情况。为进步明确筛选出的miR-126对EPCs功能的影响，我们首先构建过表达miR-126的慢病毒或者miR-126的抑制剂，分别转染体外培养的对照组和糖尿病组的EPCs，检测两组EPC的功能和miR-126靶基因Spred-1表达；利用克隆形成实验检测EPCs克隆形成能力；MTT试剂盒检测细胞增殖能力；流式细胞技术检测细胞凋亡和分化；改良的boyden小室模型检测细胞迁移功能；定量PCR和免疫印迹检测Spred-1表达。进一步构建miR-126的靶基因spred-1的慢病毒，单独或者和spred-1慢病毒共同转染对照组和糖尿病组的EPCs，检测细胞克隆形成、增殖、凋亡、分化和迁移功能。定量PCR和免疫印迹检测Ras/ERK/VEGF和PI3K/Akt/eNOS信号通路基因的表达水平。【结果】通过筛选糖尿病患者和非糖尿病患者EPCs中microRNA的表达，成功筛选出在糖尿病患者中显著减少的6个microRNAs,分别为miR-21, miR-27a，miR27b，miR-126，miR-130a，miR-107。本研究发现，糖尿病患者EPCs的miR-126表达下降伴随细胞克隆形成能力、细胞增殖速度、细胞迁移能力减弱，细胞凋亡增加。过表达miR-126可以显著改善糖尿病组EPCs的克隆形成能力，增加糖尿病组EPCs的细胞增殖和细胞迁移能力，减少糖尿病EPCs的凋亡；抑制miR-126的水平则导致细胞克隆形成和增殖能力降低，细胞迁移受抑，促进凋亡。但是我们发现miR-126的异常对EPCs分化并没有显著的影响。此外，本研究还揭示了过表达miR-126可降低其靶基因Spred-1的的mRNA和蛋白表达水平。使用抑制Spred-1表达的慢病毒转染EPCs，增加糖尿病组EPCs的细胞增殖和细胞迁移能力，减少糖尿病EPCs的凋亡。在EPCs上同时过表达miR-126和Spred-1，可显著减少细胞克隆形成和增殖，促进凋亡，抑制细胞迁移。对其机制的进步研究发现，过表达MiR-126增加糖尿病EPCs上p-ERK1/2/VEGF和Akt/eNOS表达，而Spred-1激活抑制了上述基因的表达。【结论】糖尿病患者EPCs中miR-21, miR-27a，miR27b，miR-126，miR-130a,miR-107表达下调。对miR-126研究发现，在糖尿病EPCs中，miR-126表达降低，Spred-1表达上升，导致了EPCs克隆形成和增殖能力减弱，细胞凋亡增加，迁移能力减弱。miR-126通过下调EPCs上Spred-1的表达，改善了细胞增殖、迁移能力，减少细胞凋亡，修复糖尿病EPCs的功能损伤。第二部分MiR-130a介导RunX3修复糖尿病内皮祖细胞功能损伤【目的】我们前期通过microRNA芯片筛选发现，miR-130a在糖尿病EPCs中表达异常下降，本研究通过研究miR-130a和EPCs功能的关系，阐明miR-130a修复糖尿病EPCs的机制，明确miR-130a在调控EPCs修复血管损伤中的作用。【方法】应用生物信息学分析寻找miR-130a的靶基因，并用荧光素酶报告基因实验证实。分别给糖尿病和正常人EPCs转染miR-130a的抑制剂(抑制miR-130a表达的siRNA序列)，定量PCR和免疫印迹检测靶基因的表达；BrdUrd实验观察，细胞增殖流式细胞仪检测细胞凋亡，修饰的Boyden小室检测细胞迁移能力。再分别构建过表达130a（Lenti-130a）、Runx3(Lenti-Runx3)和下调Runx3的慢病毒(Lenti-Runx3-SH);单独转染miR-130a抑制剂或者同时转miR-130a抑制剂和Lenti-Runx3;单独转染Lenti-130a或者同时转Lenti-130a和Lenti-Runx3-SH;检测转染后糖尿病和正常人EPCs迁移、克隆形成能力，流式细胞仪检测细胞分化指标CD64和vWF的表达。免疫印迹检测PI3K/AKT-1和VEGF/ERK1/2表达。【结果】报告基因实验证实Runx3是miR-130a的靶基因，miR-130a抑制Runx3的mRNA和蛋白的表达。抑制糖尿病EPCs的miR-130a表达，减少细胞增殖、克隆形成和迁移能力，促进细胞凋亡，抑制细胞分化。单独转染过表达miR-130a或干扰Runx3慢病毒，增加了EPCs细胞增殖、克隆形成和迁移能力,促进细胞分化。同时转染过表达miR-130a和干扰Runx3慢病毒，增加了EPCs细胞增殖、克隆形成和迁移能力,促进细胞分化，促进血管生成。MiR-130a上调刺激了PI3K/AKT-1和VEGF/ERK1/2功能激活。【结论】糖尿病EPCs中MiR-130a表达下调，损伤了EPCs功能。MiR-130a能修复糖尿病EPCs功能损伤，促进EPCs增殖、克隆形成和迁移能力和细胞分化。MiR-130a通过靶基因Runx-3激活PI3K/AKT-1和VEGF/ERK1/2信号通路，修复EPCs功能损伤。第三部分miR-107介导HIF1β抑制内皮祖细胞分化【目的】缺血性心脏病是危害国民健康的主要疾病之，促进内皮祖细胞（EPCs）分化为成熟内皮细胞（ECs）的对修复血管损伤，治疗缺血性心脏病具有重要意义。本研究通过阐明低氧环境下miR-107调控EPCs分化为成熟ECs机制和作用，明确miR-107在减少内皮损伤和促进损伤血管内皮再生中的作用。【方法】分离大鼠骨髓单个核细胞中的EPCs，进行诱导培养和纯化，通过乙酰化低密度脂蛋白DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1双染法及流式细胞仪(细胞表面标记CD34、KDR和CD133)鉴定EPCs。常氧和低氧条件下培养EPCs，分别在第6天，第10天，第14天用定量PCR检测miR-107表达，并用流式细胞仪检测内皮细胞表面标记CD31，免疫印迹检测eNOS，间接观察氧化氮的分泌水平。以此两项指标作为判断EPCs分化情况的标准。构建过表达miR-107的慢病毒，进行四组处理：1.常氧组；2.常氧上调miR-107组；3.低氧组；4.低氧上调miR-107组。再构建抑制miR-107表达的慢病毒，进行四组处理：1.常氧组；2.常氧下调miR-107组；3.低氧组；4.低氧下调miR-107组。第14天检测EPCs的分化程度,即用流式细胞仪检测内皮细胞表面标记CD31及vWF，并用定量PCR和免疫印迹检测eNOS、HIFβ。构建过表达HIFβ的慢病毒，进行四组处理：1.常氧组；2.常氧并同时上调miR-107与HIF1-β组3.低氧组；4.低氧并同时上调miR-107与HIF1-β组。流式细胞仪检测内皮细胞表面标记CD31及vWF，免疫印迹检测eNOS、HIFβ表达。【结果】低氧促进miR-107、eNOS和CD31表达，加快EPCs向内皮细胞分化。低氧情况下，我们过表达miR-107，定程度上抑制EPCs分化；下调miR-107表达则促进EPCs分化。下调miR-107增加靶基因HIF1-β的表达，促进EPCs的分化。因此，低氧下miR-107负反馈表达增加，可以通过减少靶基因HIF1-β表达，定程度抑制EPCs分化。常氧及低氧条件下同时下调miR-107与HIF1-β，发现低表达miR-107对eNOS等的上调作用消失，同时分化程度与对照（仅作低氧处理的组）相同。说明低表达miR-107对eNOS等的上调是通过上调HIF1-β实现。【结论】通过研究miR-107在低氧下对EPCs分化的作用机制，我们发现低氧促进内皮祖细胞向内皮细胞分化，内源性miR-107表达增加，是低氧下HIF-1β表达水平没有明显变化的原因。低氧情况下EPCs内源性miR-107表达增加，miR-107通过调控靶基因HIF1β减少HIF1活性，抑制EPC分化。