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研究背景：前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是环加氧酶转化花生四烯酸后的主要产物。作为机体内一种重要的脂类信号分子,PGE2广泛参与了多种肿瘤的发生发展过程,其中包括肝癌。PGE2通过与细胞膜上的四种EP受体(Eprostanoid receptor,EP1受体、EP2受体、EP3受体、EP4受体)结合,促发胞内信号转导和调控基因表达,从而起多方面的生物学作用。本实验室的前期研究结果显示,PGE2能够显著促进肝癌细胞的生长、迁移和侵袭,但其中的分子机制并不十分清楚。c-myc是细胞的一种原癌基因,其编码产物为核转录因子c-Myc蛋白。c-Myc蛋白可结合到靶基因上并招募相关因子来上调许多靶基因的转录表达,进而促进细胞的增殖和肿瘤的发生发展。c-myc基因激活或过表达也参与了肝癌的发生发展。c-myc本身也受到细胞生长信号的调节,胞外的多种信号分子结合相应受体后可促发胞内信号转导进而上调或激活c-myc的表达,最终促进细胞生长和增殖等。有资料显示,肝癌组织中环加氧酶2(PGE2合成的限速酶)和c-Myc蛋白的表达存在正相关。然而截至目前,有关PGE2调节肝癌细胞中c-Myc表达的作用和机制及其在PGE2促肝癌细胞生长和侵袭中的作用研究,未见报道。研究目的：1.研究PGE2对肝癌细胞c-Myc mRNA转录和蛋白表达的影响。2.研究c-Myc蛋白在PGE2促肝癌细胞生长和侵袭中发挥的作用。3.研究EP4受体在PGE2调节肝癌细胞c-Myc表达中发挥的介导作用。4.阐明EP4受体激活上调肝癌细胞c-Myc表达的信号转导通路和分子机制。研究方法：1.运用常规方法培养人的肝癌细胞系Huh7。2.采用WST法检测PGE2等处理对肝癌细胞生长的影响。3.采用Transwell法检测PGE2等处理对肝癌细胞侵袭能力的影响。4.应用PGE2、EP4受体激动剂并结合使用信号通路中关键靶点的抑制剂、激活剂、siRNA干扰共同作用肝癌细胞,采用Real-time PCR方法分析其对细胞中c-Myc mRNA转录水平的影响,用Western Blot方法检测肝癌细胞中c-Myc的蛋白表达水平。5.运用EIA试剂盒分析EP4受体激动剂对肝癌细胞中cAMP水平的影响。研究结果：1.用3μM的PGE2处理Huh7肝癌细胞,在0h到2h的时间段内,其细胞中c-Myc的蛋白表达水平稳步上升,到2h时升至最高,为0h的183%倍。而且,3μM的PGE2处理也能快速上调细胞中c-Myc的mRNA转录水平,在1h时达到峰值,为Oh的5.16倍。2.用0到10gM梯度剂量的PGE2处理肝癌细胞2h, Western Blot实验结果表明,0.1μM的PGE2已经使肝癌细胞中c-Myc的蛋白表达升至对照组的172%倍,在0.3μM到10μM的范围内,PGE2处理都使其蛋白水平维持在高于对照组50%的水平上。Real-time PCR实验结果显示,剂量为0.1μM到10μM的PGE2处理肝癌细胞1h都能使细胞中的c-Myc mRNA转录水平明显上调,其数值都在对照组的3倍以上。3.WST实验结果表明,PGE2处理肝癌细胞24h使其相对增殖率升至对照组的112%,而使用c-Myc siRNA干扰后再加PGE2其相对增殖率降为对照组的98%,同时单一c-Myc siRNA干扰也使其相对增殖率下降为对照组的93%。4. Transwell侵袭实验表明,PGE2处理肝癌细胞24h,其相对侵袭率升高为对照组的132%,而在使用c-Myc siRNA干扰后以PGE2处理其相对侵袭率降为对照组的91%。5.用3μM的EP4受体激动剂PGE1alcohol处理肝癌细胞在0h到2h的时间段内,其细胞中的c-Myc蛋白表达水平稳步上升,由0h的100%上升至2h的161.5%。而使用0州到10μM梯度剂量的PGE1alcohol处理肝癌细胞2h,其胞内的c-Myc蛋白表达也随着PGE1alcohol剂量的加大而逐渐升高,由0.1μM剂量组的128.5%逐渐升至10μM剂量组的190%。6. Real-time PCR实验结果表明,使用3μM剂量的EP4受体激动剂PGE1alcohol处理肝癌细胞,在0h到2h的时间段内,细胞中c-Myc的mRNA转录水平先快速上升,到1h时达到最高值为0h的4.71倍,而后有所下降,到2h时仍为对照组的1.32倍。而使用0μM到10μM梯度剂量的PGE1alcohol处理肝癌细胞1h后,其细胞中c-Myc的mRNA转录表现为随其剂量加大而逐渐上升的趋势,于3μM至10μM剂量时为最高值,分别为对照组的4.06倍和4.05倍。7.使用4μM的EP4受体拮抗剂GW627368X预处理肝癌细胞1h后再加PGE2或PGE1alcohol处理2h,其对c-Myc蛋白表达水平的影响由单一加PGE2或PGE1alcohol的192.3%和191.7%下降到GW627368X预处理后加PGE2或PGE1alcohol组的105.3%和78.3%,同时单一GW627368X处理也使细胞中c-Myc的蛋白表达水平降为对照组的69%。而通过Real-time PCR方法分析GW627368X预处理对PGE2或PGE1alcohol诱导的肝癌细胞c-Myc mRNA转录上调的影响发现,其预处理也显著抑制了PGE2或PGE1alcohol对c-Myc mRNA转录的上调作用,其效应和对c-Myc蛋白表达水平的抑制作用完全一致。8.使用siRNA干扰实验下调肝癌细胞的EP4受体表达,而后再以Western Blot实验检测其对PGE2或PGE1alcohol上调c-Myc蛋白作用的影响。结果表明,使用EP4受体特异的siRNA干扰使得c-Myc的蛋白表达水平从"N.C.siRNA+PGE2"和"N.C.siRNA+PGE1alcohol"组的173.1%和160.9%显著下降为‘’EP4siRNA+PGE2"和‘’EP4siRNA+PGE1alcohol"组的82.3%和65.5%。同时单一EP4受体siRNA干扰也使c-Myc的蛋白表达水平下降为对照组的55.0%。9.用5μg/ml的基因转录抑制剂Act D或50μg/ml的蛋白合成抑制剂CHX预处理肝癌细胞1h,而后再用EP4受体激动剂PGE1alcohol处理2h并结合Western Blot实验分析细胞中的c-Myc蛋白表达,结果显示c-Myc蛋白表达由单一PGE1alcohol处理的194%下降为“PGE1alcohol+Act D"组的59.5%和"PGE1alcohol+CHX"组的36.5%,同时单一Act D、CHX处理也显著下调了细胞中c-Myc蛋白的本底水平,分别下降为53%和34%。10.用EP4受体的激动剂PGE1alcohol处理肝癌细胞0min到60min后,采用EIA实验分析胞内cAMP水平,结果显示PGE1alcohol处理5min其cAMP水平就升至对照组的433.3%倍,30min至45min时达到最高,为对照组的1555.9%倍和1554.9%倍,到60min时稍有下降,但仍为对照组的1247.1%倍。11.用0μM到20μM梯度剂量的腺苷酸环化酶激动剂Forskolin处理肝癌细胞2h,能使其胞内的c-Myc蛋白表达水平显著升高,并呈现出剂量依赖性关系,10μM剂量处理时达到最高为对照组的295.7%倍。Real-time PCR实验结果显示0μM到20gM梯度剂量的Forskolin处理肝癌细胞1h后,细胞中的c-myc mRNA转录表现为类似的上调,剂量为0.5μM的Forskolin处理使肝癌细胞c-myc的mRNA转录水平升至对照组的2.651倍,随着Forskolin剂量的加大其mRNA转录水平也逐渐升高,于20gM剂量处理时达到峰值,为对照组的6.054倍。12.用200μM的腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536预处理可有效阻断PGE1alcohol所致的c-Myc蛋白上调,c-Myc蛋白水平由单一加药PGE1alcohol组的212.5%下降到PGE1alcohol加SQ22536抑制组的109.5%,同时SQ22536也显著下调了肝癌细胞中c-Myc蛋白的本底水平,数值降为66.5%。转录水平的检测结果显示,SQ22536预处理也部分抑制了PGE1alcohol所致的c-Myc mRNA转录上调,使其水平由“PGE1alcohol"组的4.65下降到’PGE1alcohol+SQ22536”组的3.93。13.用10μM的PKA抑制剂H89预处理可有效阻断PGE1alcohol所诱导c-Myc蛋白上调作用,其数值由PGE1alcohol处理组的258%下降为PGE1alcohol加H89同时处理组的128%,接近本底水平。同样,在mRNA转录水平,H89预处理也有效阻断了PGE1alcohol所诱导的c-Myc转录水平上调,其数值由PGE1alcohol组的4.11下降为PGE1alcohol加H89同时处理组的1.11。14.用3μM的EP4受体激动剂PGE1alcohol处理肝癌细胞在0min到60min内,其使胞内CREB蛋白的Ser133位点磷酸化水平显著上升,5min时为对照组的515%倍,15min后就达到最高值为对照组的827%倍,直到60min时细胞中都保持着很高的CREB磷酸化水平。15.CREB siRNA干扰不仅降低了肝癌细胞中c-Myc蛋白的本底水平,而且有效抑制了EP4受体信号对c-Myc蛋白的上调作用,使其从“阴性对照siRNA干扰+PGE1alcohol"组的175.5%下降到’CREB siRNA干扰+PGE1alcohol"组的97%。16.10μM到40μM的P13K抑制剂LY294002预处理抑制了PGE1alcohol所诱导的肝癌细胞c-Myc蛋白上调,其数值从PGE1alcohol组的245%下降为10μM,20μM,40μM的LY294002与PGE1alcohol共处理组的157.5%,119.5%,121%。同时单一LY294002处理也使肝癌细胞中c-Myc的蛋白表达水平有所下调。结论：PGE2通过结合EP4受体促发了胞内偶联的Gs/AC/cAMP/PKA/CREB信号通路和Akt通路协同作用,上调了肝癌细胞中c-Myc的mRNA转录和蛋白表达,进而促进了肝癌细胞的生长和侵袭作用。