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小地老虎Agrotis ipsilon属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是一种危害严重的农业害虫，可取食多种作物以及几乎所有蔬菜。小地老虎的防治主要依赖化学防治，然而频繁不合理的使用杀虫剂导致了小地老虎抗药性的产生。同时，小地老虎幼虫地下危害的特点也增加了防治难度。CRISPR/Cas9技术是新兴的基因组编辑技术，已在多种昆虫实现靶标基因的编辑，具有应用于开发高效特异且环境友好的遗传防治方法的潜力。本研究中，建立了基于CRISPR/Cas9技术的小地老虎基因组编辑体系，并实现了对多个基因的定点编辑。具体研究结果如下: 1.小地老虎胚胎注射体系的建立。依照小地老虎产卵习性，建立了“强光抑制-黑暗刺激”方案，可在短时间内收集大量新鲜的受精胚胎，可在胚胎发育2小时内完成注射，提高了突变效率及突变遗传的概率。 2.小地老虎Yellow基因家族鉴定及敲除。在小地老虎中鉴Yellow基因家族成员yellow-y，yellow-b，yellow-b2，yellow-e，yellow-d,yellow-e和yellow-h。利用RT-PCR分析了这些基因的时空表达模式，发现部分基因存在龄期或组织表达特异性。利用CRISPR/Cas9技术成功敲除了yellow-y基因，突变检测发现在靶点位置发生了不同类型的插入-缺失突变。表型分析发现，yellow-y敲除突变体初孵幼虫头壳和身体变黄，整个幼虫期都维持黄化表型，而在蛹期体色与野生型相别无显著变化，成虫期身体、翅、触角、四肢等均变为黄色。进一步分析发现，yellow突变表型可以稳定遗传至后代。至此，验证了CRISPR/Cas9技术可造成小地老虎靶基因突变，并可稳定遗传。 3.小地老虎双性基因doublesex鉴定及敲除。由于性别决定基因具有应用于遗传防治的潜力，鉴定出了小地老虎双性基因doublesex（dsx）。小地老虎雌性中存在多种dsx可变剪切体，雄性中只有一条可变剪切体。RT-PCR分析发现胚胎期6小时雄性特异dsx开始表达，说明小地老虎性别决定完成的时间是在胚胎期6小时左右。利用CRISPR/Cas9技术分别成功敲除了雌雄特异的dsx可变剪切体，获得了dsx雌雄特异可变剪切体的敲除突变体，发现在蛹期突变体外生殖器处出现中间性别表型;成虫期突变体外生殖器及生殖腺均发生不同程度变异;突变体触角出现中间性别表型，电镜观察发现雄性dsx突变体触角上负责结合性信息素的毛状感器数量显著减少。证明了小地老虎dsx是调控性二态的重要因子。