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2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol,2-ME),作为雌二醇的内源性代谢物,因其具有广谱抗肿瘤活性,且毒性较低,近年来被广泛关注,口服胶囊已被FDA批准进行二期临床研究。2-ME在水中难溶,半衰期短,体内又易快速羟基化、脱氢而形成非活性代谢物,且存在明显的肝首过效应,难以维持有效血药浓度,致使其口服生物利用度较低,同时Ⅰ期临床结果表明其口服吸收无规律,药代动力学参数与剂量之间缺乏相关性。为了解决2-ME水中难溶、肝首过效应及生物利用度低的问题,结合纳米混悬剂这种新型给药系统的特点,本文采用纳米沉淀-超声粉碎法制备2-ME纳米混悬液,从体内、体外对其进行了系统地研究和探讨,以期为2-ME的开发和临床应用提供更多借鉴,现将本文的主要研究内容摘要如下:
1.2-ME纳米干混悬剂的制备和表征。采用纳米沉淀-超声粉碎法制备2-ME纳米混悬液,冷冻干燥后所得粉末可成功地提高药物的溶出速度,在最初的10min内,其溶出速率是2-ME原料药的45倍以上,体外溶出速率的增加将有利于药物生物利用度的提高。制备的纳米混悬剂以粒径和电位为评价指标,用扫描电镜、差示扫描量热法及X射线衍射法进行了表征。结果表明,2-ME纳米干混悬剂呈无定形粉末状,复溶后平均粒径(244.5±5.8)nm(PDI0.23±0.02),电位(-34.4±2.2)mV,物理稳定性研究显示,4℃放置6个月后粒径和药物含量均未见明显变化。
2.2-ME纳米混悬液大鼠体内药动学和组织分布研究。以SD大鼠为试验对象,通过尾静脉注射给药(10mg/kg),采用HPLC法测定不同时间点大鼠血浆及各组织中的药物浓度,以此评价2-ME纳米混悬液(正电荷、中性和负电荷)和2-ME普通溶液的体内行为。结果表明2-ME制成纳米混悬液后,其体内行为发生改变。2-ME-N(2-ME纳米混悬液,荷负电)的T1/2α、T1/2β和V(c)分别是2-ME-S(2-ME溶液)的1.67、2.23和3.18倍,具有一定的缓释效果。负电荷2-ME-N相比于正电荷2-ME-N具有较高的T1/2α、T1/2β和V(c),但二者AUC之间无统计学差异。体内分布结果表明,中性2-ME-N在脾、心和肝中分布较多,肾中分布最少,没有明显的靶器官;正电荷2-ME-N在脾中的浓度最高,脾的总靶效率为51.24％；负电荷2-ME-N对肺、肝和脾等组织具有良好的选择性,其中肺的靶向性效果显著,总靶效率达82.72％,比2-ME溶液肺的TEc值(47.69％)增加35.03％。
3.2-ME纳米混悬液体外细胞毒作用研究。应用MTT法对2-ME-N(负电荷)在体外对人食管癌EC9706细胞的细胞毒作用进行研究。结果显示,与2-ME-S相比,2-ME-N对细胞的生长抑制作用明显增强,2-ME-S的IC50值是2-ME-N的2.29倍。
4.2-ME纳米混悬液对裸鼠人食管癌移植瘤抑制作用研究。裸鼠皮下接种EC9706细胞建立裸鼠移植瘤模型,30只荷瘤裸鼠随机分为5组,每组6只,分别为阴性对照组,阳性对照组(5-FU-S,20 mg·kg-1·d-1),2-ME-N低、中、高剂量治疗组(15,30,60 mg·kg-1·d-1)。治疗7d后处死裸鼠,剥离瘤体称重并计算抑瘤率。TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数,免疫组化SP法检测移植瘤组织VEGF、EGF、Ki-67和HIF-1α的表达。结果表明,阳性对照组和2-ME-N低、中、高剂量组均能抑制肿瘤的生长,抑瘤率分别为67.76％,27.47％,63.63％和78.42％,与阴性对照组比较均有显著性差异,2-ME-N低、中、高剂量组肿瘤抑制率呈现剂量依赖性。2-ME各剂量组的凋亡指数分别为(25.1±2.5)％、(39.4±5.1)％和(63.1±4.3)％,与阴性对照组(11.5±1.6)％比较,差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。免疫组化结果显示,2-ME能明显抑制移植瘤组织VEGF、EGF、HIF-1α及Ki-67的表达,其作用机制可能是通过下调肿瘤细胞内VEGF、EGF、HIF-1α及Ki-67的表达,从而抑制肿瘤细胞的增长。
5.2-ME对人食管癌EC9706凋亡和凋亡基因Cyclin B1/c-Myc表达的影响。采用MTT法检测2-ME对人食管癌EC9706细胞生长的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,结果表明,2-ME抑制人食管癌EC9706细胞的生长呈时间及浓度依赖性。作用72h后,10μmol/L的2-ME对细胞生长的抑制率达60％,该浓度24 h的凋亡率由(2.38±0.42)％增加到(29.15±0.73)％；1-10μmol/L时,G1期和S期细胞比例明显下降,G2/M期细胞比例增加；同时1-10μmol/L的2-ME可上调人食管癌EC9706细胞CyclinB1及c-Myc的表达,提示2-ME可诱导人食管癌EC9706细胞发生凋亡,其机制可能与上调Cyclin B1及c-Myc的表达有关。