潘那利番茄苗期耐盐非编码RNA的鉴定及SpCDPK4功能解析

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盐胁迫影响番茄的整个生长发育进程,种子萌发和幼苗期的番茄对盐分较为敏感。野生番茄潘那利(Solanum pennellii)耐盐性状优异,是番茄抗逆性育种不可多得的研究材料。本研究通过下一代测序技术,首次鉴定了栽培番茄M82和野生番茄潘那利中盐胁迫响应相关的编码及非编码RNA,同时基于生物信息学手段构建了m RNA和micro RNA、lnc RNA之间的竞争性表达失调网络,筛选了耐盐番茄潘那利中盐胁迫核心响应基因元件及信号通路,并针对核心基因进行原核表达、亚细胞定位和转基因体系构建等功能组学研究,揭示了野生番茄潘那利盐胁迫响应机理。为番茄培育耐盐品种及耐盐分子机制提供理论依据,为农作物抗逆育种提供候选基因资源,同时对促进番茄生态产业多元化具有重要应用价值。(1)以盐胁迫处理0 h和12 h的潘那利番茄与栽培番茄M82的根为材料,进行全转录组测序分析。分析在盐胁迫12 h下两个品种中lnc RNAs表达模式和潜在靶基因的差异。总共鉴定了1044个假定的lnc RNAs,它们分布在所有染色体上。其中1号染色体上的lnc RNAs最多,有117个,2号和6号染色体上只有58个。在盐胁迫下137个lnc RNAs在野生番茄中差异表达,其中37个上调,100个下调。GO和KEGG分析显示,125个DE-lnc RNAs靶向M82中的1227个靶基因,而111个DE-lnc RNAs靶向潘那利番茄中的1268个m RNAs。确定9个lnc RNAs为10个已知的番茄mi RNA前体,包括mi R319a、mi R396b、mi R7981c/d/e/f、mi R10532、mi R10538、mi R1919b和mi R1919c。M82和潘那利番茄中分别有23和21个lnc RNAs分别被判定为34和28个mi RNAs的可能靶点,其中与非生物胁迫有关的mi RNA,有sly-mi RNA159、slymi RNA319A等。(2)对栽培番茄M82和潘那利番茄mi RNA-seq数据分析,所有样品结果共得到370个mi RNAs,其中64个为已知mi RNAs,306个为新预测的mi RNA。新预测的mi RNA中有213个长度为24 nt,占比69.61%,新预测的24 nt的mi RNAs中,潘那利番茄数目要远高于栽培番茄,该长度mi RNA主要来源于基因组重复序列。盐胁迫处理下M82和潘那利番茄之间存在27个差异表达mi RNAs,其中5个mi RNAs为上调表达,22个mi RNAs为下调表达,16个mi RNAs为已知mi RNA,且全部为下调表达,其中12个mi RNAs为新鉴定mi RNA。盐胁迫下两种番茄所有差异表达mi RNA共预测到681个靶基因,其中15个已知差异表达mi RNAs靶向341个靶基因,10个新预测mi RNAs靶向340个靶基因。差异表达mi RNAs靶基因的注释结果显示,差异靶基因大量分布在糖酸代谢通路中,并被特异富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、赖氨酸降解等7个氨基酸代谢通路中。差异表达mi RNA及其靶向的靶基因联合分析,最终获得13个已知mi RNAs调控15个m RNAs,其中slymi R482b、sly-mi R164a-5p、sly-mi R166c-3p和sly-mi R9470-3p分别调控NBS-LRR、NAC、HD-ZIP和ERF等转录因子家族成员,sly-mi R156d-3p和sly-mi R395a靶向调控ACAD10和硫酸盐转运体的表达。(3)本研究通过组学数据综合分析,筛选确定CDPK为研究对象。基于CDPK基因家族保守结构域,利用HMMER软件和本地Blastp方法对潘那利番茄基因组进行检索,共鉴定到31个Sp CDPKs;系统发育分析显示所有Sp CDPK基因分为4个亚家族;潘那利番茄Sp CDPK家族基因数目少于拟南芥中的34个,但多于栽培番茄中的29个;基因结构和剪切位点显示,Sp CDPK家族基因存在较为复杂的外显子-内含子模式和大量m RNA异构体表达潜力;物种间共线性表明潘那利番茄与M82中的CDPK基因保持着高度同源,他们可能参与介导相同或相似功能;Sp CDPK扩增机理的研究发现全基因组复制倍增是潘那利番茄CDPK家族基因扩张的主要原因;相互作用蛋白结果显示Sp CDPK与大量离子运输蛋白协同表达,参与潘那利番茄多种生命活动;最后基于RNA-seq的技术对潘那利番茄中所有Sp CDPKs盐胁迫响应机制进行了研究,依据高盐环境下Sp CDPKs差异表达情况,初步筛选了对潘那利番茄耐盐能力提升具有积极意义的7个Sp CDPKs作为候选基因,为下一步基因可能和功能解析提供了基础。(4)基于同源克隆技术,从野生潘那利番茄中获得Sp CDPK4的全长序列,Sp CDPK4的开放阅读框长度为1746 bp,编码581个氨基酸,理论蛋白分子量约为64.58 k Da,等电点为5.54,是非分泌型、亲水的稳定蛋白,且定位于细胞膜上;多序列比对及系统发育树分析表明,Sp CDPK4编码的氨基酸序列与栽培番茄Sl CDPK4(XP_010327694.1)、马铃薯St CDPK4(NM_001287877)相似度最高,相似性均为65.1%,与拟南芥At CDPK20亲缘关系最近归为第二类。SDS-PAGE电泳检测结果发现在70 k Da左右处有一条特异表达的蛋白条带,与预期目的产物大小一致,且WesternBlot结果显示其能与Anti-His单克隆抗体发生特异性反应。过表达Sp CPK4能显著增强重组大肠杆菌对盐的耐受性。RT-q PCR结果表明,Sp CDPK4在潘那利番茄不同组织中均有表达,且根中的表达量显著高于叶和茎;此外在盐胁迫下,Sp CDPK4在根中的表达量迅速积累,且在1 h时达到峰值。转基因番茄盐胁迫处理48 h后,对照植株明显萎蔫严重,初步说明该基因可能与植物的耐盐性相关。
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