【摘 要】
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Brazzein是一种来源于非洲热带植物的甜味蛋白质,具有甜度高、能量低、稳定性好等优点。但是天然甜味蛋白产量低,市场价格高;其次,该甜味蛋白质在异源表达时不能正确折叠或糖
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Brazzein是一种来源于非洲热带植物的甜味蛋白质,具有甜度高、能量低、稳定性好等优点。但是天然甜味蛋白产量低,市场价格高;其次,该甜味蛋白质在异源表达时不能正确折叠或糖基化等,也限制了甜味蛋白大规模的商业化生产与应用。本研究将优化的brazzein基因序列克隆入载体pET-SUMO(带有促溶标签SUMO-tag),并导入大肠杆菌表达系统,实验证明带有促溶标签的重组蛋白没有甜味,酶切之后蛋白不仅有甜味,而且甜味强烈,经过甜味测定野生型甜味蛋白brazzein的甜味阈值达到了1.5ug/mL,变性温度为92°C,表明基因合成的甜味蛋白brazzein和天然的甜味蛋白具有同样好的热稳定性。我们从蛋白表面电荷角度和前人研究成果的基础上,设计突变。通过实验我们获得了蛋白甜度明显提高的突变体蛋白(V7R、E9K、D29N、D40K、E41A、D50K和E53R),尤其是D50K,它的甜度是野生型的5倍,甜味阈值达到了0.3ug/mL,突变体E53R的甜味阈值为0.5ug/mL,说明了灵活的C末端也是brazzein与甜味受体作用的主要位点之一。为了更好的理解甜味蛋白与甜味受体的相互作用,在单个氨基酸残基突变的基础上,构建了5个双突变和2个三突变,其中D29N/D50K甜度提高的最明显,甜味阈值为0.4ug/mL。双突变(D29N/E53R和D40K/E53R)甜度都不如单突变,且三突变(D29N/D40K/E53R)较双突变甜度也降低了,甜味蛋白brazzein可能与甜味受体表面的多个位点结合,多突变甜味增强并不是一个普遍的规律。
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