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卵巢是雌性哺乳动物生殖系统中最主要的器官之一,在神经系统和下丘脑-垂体-性腺轴激素的调节下,能够周期性产生卵子并分泌比例均衡的生殖激素(毛文智2007);卵巢上卵泡与黄体周期性的交替变化,调节动物的全部生殖生理过程。雌激素是与动物繁殖直接相关的生殖激素,参与调控哺乳动物的发情和性行为(Eric R et al.2014)。雌激素是一类化学结构相似,分子中含有18个碳原子的类固醇激素,通过结合雌激素受体发挥其生理作用。雌激素核受体(estrogen receptors,ERs)是发现较早的雌激素受体,包括雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)和雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型,ERs定位于细胞核,通过调节靶基因的转录而发挥基因调节作用(安胜军,张永祥2002)。但越来越多的证据显示,ERs并不足以完成雌激素的全部作用,在某些条件下,雌激素的作用极快,这表明雌激素还存在一种快速的非基因组的调节作用。近年来的研究发现,在许多类型细胞的细胞膜上,存在一种G蛋白耦联的受体30(G protein-coupled receptor 30,GPR30),这种膜受体能够介导雌激素的快速非基因组效应(Prossnitz and Barton 2011)。本实验室前期的研究发现在山羊卵丘-卵母细胞复合体上存在着GPR30的表达,在卵母细胞体外成熟培养过程中,培养基中添加GPR30的激动剂或抑制剂对卵母细胞成熟进程有着不同的影响,因此推断GPR30在卵母细胞成熟过程中发挥着重要的作用。为了进一步证明GPR30在山羊发情周期和卵母细胞成熟过程中的作用,本研究主要通过检测GPR30在山羊发情周期不同阶段卵巢中的表达与定位,并进一步检测GPR30在不同发育阶段卵泡、黄体以及闭锁卵泡中的表达规律,为GPR30在卵巢周期调控、卵泡发育和卵母细胞成熟中的作用研究奠定基础。本研究利用石蜡切片和H.E.染色结合卵巢外部结构观察,根据卵巢表面卵泡和黄体发育情况以及H.E.染色结果,判断山羊卵巢所处的发情周期,利用免疫组织化学法检测GPR30在发情周期不同阶段山羊卵巢,不同发育阶段卵泡、黄体和闭锁卵泡中的表达与定位,并利用实时定量PCR技术检测不同发育阶段卵泡中GPR30 mRNA表达规律。研究工作取得以下结果:(1)根据卵巢表面卵泡和黄体发育情况以及H.E.染色结果证明,发情周期不同阶段的卵巢有着不同的外部结构,根据卵巢发情周期不同阶段典型外部结构特征,可初步判断卵巢所处的发情周期阶段。(2)卵巢组织免疫组化检测结果表明,GPR30免疫反应阳性产物广泛分布于发情周期不同阶段山羊卵巢组织中,主要定位于卵泡和黄体组织中。(3)卵巢组织免疫组化检测结果表明,在卵巢中不同发育阶段的卵泡均有GPR30阳性表达,主要定位于颗粒细胞、卵丘细胞及卵母细胞质膜和胞质;分离卵泡的实时定量PCR检测结果表明,原始卵泡中GPR30 mRNA表达量最低,随着卵泡的生长发育,GPR30 mRNA在卵泡中表达水平逐渐升高,到成熟卵泡阶段表达量达到最高。(4)卵巢组织免疫组化检测结果表明,间情期黄体中均有GPR30阳性表达,但表达强度较弱,且不同发育阶段黄体中GPR30的表达强度没有显著差异,GPR30主要定位于黄体细胞的胞质中,且在黄体组织中广泛分布。(5)卵巢组织免疫组化检测结果表明,闭锁卵泡内卵母细胞和颗粒细胞也有GPR30阳性表达,与正常卵泡相比,GPR30表达水平较低。