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基因组编辑技术尤其是新兴的 CRISPR/Cas9系统，能高效地对基因组进行靶向修饰，理论上可以实现任何物种任何基因的编辑，对生命科学、医学等都展示出巨大的研究价值。传统的基因打靶技术依赖于DNA片段的同源重组，效率低（低于10-6）。相对于ZFNs和TALENs的复杂组装，CRISPR/Cas9系统依靠guide RNA和Cas9蛋白就可以实现基因定点编辑，具有构建简单、打靶效率高、成本低等优点。本实验设计利用CRISPR/Cas9系统分别在小鼠ES细胞和胚胎水平实现基因定点敲除，并获得单等位基因敲除小鼠模型。 本课题以小鼠母源印记基因Kcnq1ot1作为敲除对象。该基因位于Kcnq1ot1印记基因簇中并起调控作用。本课题第一条技术路线为ES细胞介导的囊胚注射法制备转基因小鼠，策略为敲除Kcnq1ot1启动子以及其起始部位共3.7 kb长DNA片段，并敲入puro-eGFP。在敲除片段5’和3’端各找了3个靶位点并成功构建基于靶位点的6个gRNA和打靶载体 Kcnq1ot1-puro-eGFP-pGalk。将打靶载体、Cas9表达质粒和5’gRNA-1及3’gRNA-1共转染至小鼠ES细胞，得到单等位基因敲除ES细胞株。将单等位基因敲除细胞株扩大培养以后进行囊胚注射。采用CD1小鼠作为供胚鼠，共注射1836枚囊胚，移植826枚，共出生138只小鼠，出生率为16.7％，成功获得4只嵌合体小鼠，但没有生殖系嵌合。 第二条技术路线采用受精卵原核注射法制备转基因小鼠。同样敲除3.7 kb长DNA片段，敲入mCherry荧光报告基因。为了增加同源重组效率，将同源臂长度提高至1.5 kb，构建了基于受精卵的打靶载体 Kcnq1ot1-mCherry-pGEM-3CZF。通过本实验室建立的荧光报告基因法在质粒水平检测了6个gRNA位点同源重组修复效率，筛选出同源重组效率较高的5’gRNA-2、3’gRNA-3和打靶载体及Cas9表达质粒进行原核注射。供胚鼠为D6B2F1，共注射583枚胚胎，移植327枚，出生66只，出生率20%。因同源重组修复效率低，经初步鉴定，未发现阳性鼠，目前准备增加注射胚胎的数量以获得基因敲除小鼠。