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抗生素是目前养殖业中使用最为广泛的饲料添加剂,在畜禽生产和对疫病的防治等方面起到了重要的作用,但长期的大量使用也带来了许多问题,世界各国纷纷采取措施限制甚至禁止抗生素的使用,微生态制剂以其在促生、免疫、安全等方面的优越性,成为最有希望取代抗生素的产品。凝结芽胞杆菌具有耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性,且具有较强的抑制肠道致病菌能力。本文以益生凝结芽胞杆菌YHYDZQ1401为研究对象,通过抗逆性驯化、培养基优化、制剂工艺及制剂配方优化,研制出一种兽用微生态制剂——凝结芽胞杆菌粉剂。 本文通过对筛选的菌株YHYDZQ1401进行形态特征及生理生化特征鉴定,以及利用分子生物学手段进行16S rDNA系统发育分析,确定该菌株为凝结芽胞杆菌。凝结芽胞杆菌能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌等肠道致病菌的生长;模拟胃液、肠道、高温等逆环境驯化菌株,得到耐胃酸、胆盐、高温的抗逆性菌株;进行抗生素药敏试验,证明该菌对土霉素、硫酸庆大霉素、氨苄青霉素、杆菌肽、新霉素等大多数常用抗生素敏感,安全性良好;对金霉素耐受性最强,制剂使用过程中可考虑与金霉素联用。 对凝结芽胞杆菌固态发酵培养基配方和发酵条件进行优化。首先通过单因素实验,根据单因素筛选结果,进行PB设计实验、最陡爬坡实验;而后利用CCD设计实验方案,进行响应面分析。获得菌体数编码自变量的三元二次回归方程:Y=1.14+0.019A-1.91×10-4B-8.49×10-3C+7.55×10-3AB-7.24×10-3AC+9.70×10-3BC-0.029A2-0.04B2-0.028C2。模型的Prob>F(a)<0.05,表明该模型显著;模型失拟差Prob>F(a)>0.05,具有不显著失拟差性,相关系数R2=0.947,拟合程度良好。确定的最终培养基配方为:以麦麸为培养基基质,鱼粉蛋白胨2.68 g/kg、氯化钠0.2 g/kg、磷酸氢二钾2.4 g/kg,菌体数为1.31653×1010cfu/g,进行实验验证,测得菌体数的平均值为1.33×1010 cfu/g,与理论预测值基本符合。确定最佳固体培养基为:以麦麸为培养基质,鱼粉蛋白胨2.68 g/kg、氯化钠0.2g/kg、磷酸氢二钾2.4 g/kg,一水合硫酸锰0.3 g/kg。在优化的发酵培养基基础上,通过单因素法优化发酵培养条件,确定最终选择22 h种龄的种子液、最适接种量为30%,最适含水量为40%,最适发酵温度为40℃,发酵时间48h,最终发酵菌体数为1.71×1010cfu/g,较优化前提高28.6%。 在发酵优化的基础上,对其制剂工艺进行初步研究,确定采用恒温干燥的方式,干燥温度50℃,粉碎时间15s。而后采用单因素筛选结合正交试验设计,对其干燥保护剂、填充剂、抗氧化剂的添加进行研究,初步确定了其制剂配方为:在发酵后湿物料中加入20%的海藻糖、150%的硅藻土、100%的膨润土,经干燥粉碎后混入0.2%的叔丁基-甲基苯酚。在室温条件下贮存6个月,样品活性保持在87.43%,制剂稳定性较好。