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鱼类骨骼肌不仅是体内主要的蛋白质储存库，还是代谢活跃和适应代谢变化高度可塑性的组织。支链氨基酸（branched chain amino acids,BCAA）是唯一在骨骼肌中高速率代谢的氨基酸。在饥饿等逆境条件下，BCAA能增强氧化提供能量以维持机体正常生命活动。Krüppel样因子15（Krüppel-like factor15,KLF15）在成年小鼠肌肉中表达呈现显著的昼夜节律性并且参与调控骨骼肌BCAA代谢。鳜（Siniperca chuatsi）肉质鲜美，营养价值高，已成为中国淡水养殖的重要品种之一。本研究以鳜鱼为对象，分析研究了在不同饥饿时长下鳜核心生物钟基因、KLF15和BCAA代谢关键酶共同调控肌肉组织BCAA代谢适应性变化的机制，筛选到不同饥饿时长下与KLF15基因节律性表达强关联性的核心生物钟基因和BCAA代谢关键酶基因，并且通过双荧光素酶报告基因实验和基因敲低技术初步验证了KLF15-BCAA钟控调控通路。主要研究结果如下：
1.筛选到不同饥饿时长下与KLF15基因节律性表达强关联性的核心生物钟基因
正常投喂时，只有Tim基因与KLF15基因呈显著的强相关；饥饿1d时，Clock和Tim基因与KLF15基因呈显著的强相关；饥饿3d时，核心生物钟基因与KLF15基因关联性减弱；饥饿5d时，仅Clock基因与KLF15基因呈显著的强相关；至饥饿7d时，Clock、Arntl1和Per2基因与KLF15基因呈显著的强相关。其中Clock基因在多个饥饿时长下与KLF15基因关联性强，且为正相关性。结果表明，随着饥饿时长的改变，核心生物钟系统会通过不同核心生物钟基因的组合来动态调控KLF15基因以适应因饥饿产生的不利影响。
2.筛选到不同饥饿时长下与KLF15基因节律性表达强关联性的BCAA代谢关键酶基因
酶活检测结果显示：在5个不同饥饿时长中，BCAT2酶浓度除饥饿1d时昼夜节律性遭到破坏外，其余饥饿时长均呈现显著的昼夜节律性；ALT酶活在正常喂食时无昼夜节律性，经饥饿处理后，呈现显著的昼夜节律性。基因表达结果显示：在5个不同饥饿时长中，BCAT2基因在正常投喂时、饥饿1d、饥饿3d、饥饿5d中呈现显著的昼夜节律性表达，饥饿7d时其昼夜节律性消失；ALT基因一直呈现显著的昼夜节律性表达。与KLF15基因进行相关性分析发现，饥饿1d时BCAT2基因与KLF15基因呈显著的中度正相关，饥饿3d与饥饿7d时，BCAT2基因与KLF15基因呈显著的强正相关，但饥饿7d时BCAT2基因的昼夜节律性消失，其余饥饿时长则无显著相关性。ALT基因则在5个处理组与KLF15基因均无显著相关性。因此，在不同时长的饥饿过程中，KLF15可能通过动态地正调控BCAT2mRNA表达水平和酶水平来介导BCAA代谢。
3.KLF15-BCAA钟控调控通路的初步验证
采用生物信息学分析发现，KLF15基因启动子区有9个潜在的Clock结合位点，BCAT2基因启动子区有1个KLF15结合位点。通过双荧光素酶报告基因实验初步证实Clock对KLF15转录活性有明显促进作用（P＜0.05），同时初步证实KLF15对BCAT2转录活性也有明显促进作用（P＜0.05）。
通过肌肉注射KLF15的vivo-Morpholinos，KLF15mRNA表达水平和蛋白水平均显著降低（P＜0.05），同时BCAT2mRNA表达水平也显著降低（P＜0.05），ALT mRNA表达水平虽呈降低趋势但未有显著变化（P＞0.05），肌肉BCAT2酶浓度、ALT酶活、BCAA和Ala含量也未有显著变化（P＞0.05），而血清中的BCAA和Ala含量显著降低（P＜0.05）。综上所述，KLF15可以正向调控BCAT2的转录表达。
1.筛选到不同饥饿时长下与KLF15基因节律性表达强关联性的核心生物钟基因
正常投喂时，只有Tim基因与KLF15基因呈显著的强相关；饥饿1d时，Clock和Tim基因与KLF15基因呈显著的强相关；饥饿3d时，核心生物钟基因与KLF15基因关联性减弱；饥饿5d时，仅Clock基因与KLF15基因呈显著的强相关；至饥饿7d时，Clock、Arntl1和Per2基因与KLF15基因呈显著的强相关。其中Clock基因在多个饥饿时长下与KLF15基因关联性强，且为正相关性。结果表明，随着饥饿时长的改变，核心生物钟系统会通过不同核心生物钟基因的组合来动态调控KLF15基因以适应因饥饿产生的不利影响。
2.筛选到不同饥饿时长下与KLF15基因节律性表达强关联性的BCAA代谢关键酶基因
酶活检测结果显示：在5个不同饥饿时长中，BCAT2酶浓度除饥饿1d时昼夜节律性遭到破坏外，其余饥饿时长均呈现显著的昼夜节律性；ALT酶活在正常喂食时无昼夜节律性，经饥饿处理后，呈现显著的昼夜节律性。基因表达结果显示：在5个不同饥饿时长中，BCAT2基因在正常投喂时、饥饿1d、饥饿3d、饥饿5d中呈现显著的昼夜节律性表达，饥饿7d时其昼夜节律性消失；ALT基因一直呈现显著的昼夜节律性表达。与KLF15基因进行相关性分析发现，饥饿1d时BCAT2基因与KLF15基因呈显著的中度正相关，饥饿3d与饥饿7d时，BCAT2基因与KLF15基因呈显著的强正相关，但饥饿7d时BCAT2基因的昼夜节律性消失，其余饥饿时长则无显著相关性。ALT基因则在5个处理组与KLF15基因均无显著相关性。因此，在不同时长的饥饿过程中，KLF15可能通过动态地正调控BCAT2mRNA表达水平和酶水平来介导BCAA代谢。
3.KLF15-BCAA钟控调控通路的初步验证
采用生物信息学分析发现，KLF15基因启动子区有9个潜在的Clock结合位点，BCAT2基因启动子区有1个KLF15结合位点。通过双荧光素酶报告基因实验初步证实Clock对KLF15转录活性有明显促进作用（P＜0.05），同时初步证实KLF15对BCAT2转录活性也有明显促进作用（P＜0.05）。
通过肌肉注射KLF15的vivo-Morpholinos，KLF15mRNA表达水平和蛋白水平均显著降低（P＜0.05），同时BCAT2mRNA表达水平也显著降低（P＜0.05），ALT mRNA表达水平虽呈降低趋势但未有显著变化（P＞0.05），肌肉BCAT2酶浓度、ALT酶活、BCAA和Ala含量也未有显著变化（P＞0.05），而血清中的BCAA和Ala含量显著降低（P＜0.05）。综上所述，KLF15可以正向调控BCAT2的转录表达。