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血管性痴呆(vascular demensia,VD)是由一系列脑血管因素导致脑组织损害所引起的脑高级功能障碍综合征的总称,其诊断具有以下三项及以上的精神活动受损如语言、记忆、视空间技能、情感、人格、计算力和抽象判断力[1]。临床常见的血管性痴呆包括:多梗塞性痴呆、大面积脑梗塞性痴呆、皮层下动脉硬化性脑病(Binswanger病)、特殊部位梗塞所致痴呆及出血性痴呆等。随着社会老龄化及生活模式的改变,VD的发病率逐年提高,成为仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的第二大痴呆类型[2],是神经内科的常见病、多发病,不仅严重影响广大患者的身心健康和生活质量,也给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来,VD的发病呈现年轻化的趋势,日益受到广大科研和临床工作者的重视。目前VD的发病机制尚未完全明确,也无确切有效的防治方法,因此探讨VD的发病机制,制定有效的治疗方案,已成为医学领域研究的热点。学习记忆是大脑的高级神经生理活动之一。学习是经验和技能的获得,记忆则是经验和技能的保存和再现。学习和记忆是两个不同的神经生物过程,既相互联系,又密切合作,使生物体适应不断变化的外界环境[3]。大量研究表明,大脑海马等结构对学习和记忆的形成和保持具有重要意义。记忆分为瞬时记忆、短时记忆、长时记忆和永久记忆四种。较长时的记忆可能与脑内蛋白质的合成有关,而永久性的记忆则可能与新突触的建立有关[4]。海马独特的组织结构及神经生理功能可能参与了这种蛋白质和突触的合成和建立。人体的多种神经递质及体液因子参与了学习记忆的过程,如胆碱能系统、兴奋性氨基酸谷氨酸及其受体、NO及钙调蛋白等,已得到基础医学科学和临床科学的广泛证实,但由于其机制复杂,目前仍未完全明确。消旋3-正丁苯酞(dl-3n-butylphthalide,NBP),是由中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所合作开发的国家级一类新药,具有完全的自主知识产权,最早是从天然植物芹菜籽中分离提纯并消旋合成的黄色油状液体,具有较好的抗脑缺血疗效。丁苯酞抗脑缺血的机制极其复杂,是由多基因、多靶点、多环节参与的过程。通过减轻脑水肿,改善脑能量代谢、改善缺血脑区的微循环,抑制神经细胞凋亡,抗脑血栓形成、抗血小板聚集作用、抑制谷氨酸释放,降低细胞内钙浓度、抑制自由基和提高抗氧化酶活性等机制而发挥药效作用[5]。目前对丁苯酞的研究大多集中在脑缺血领域,尚缺乏对其与VD之间关系的相关研究报告。MMPs尤其是MMP-2及MMP-9在VD发病中的作用已得到越来越多科研工作者的重视,有理由认为,MMPs有可能是丁苯酞治疗VD的靶点之一。本实验研究探讨消旋3-正丁苯酞对VD大鼠的保护作用及其可能的治疗机制,进而为临床治疗提供科学的依据。目的:研究消旋3-正丁苯酞对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马MMP-2、MMP-9表达的影响,探讨丁苯酞对慢性脑缺血的治疗机制。研究方法:12—16周龄的健康雄性Wistar大鼠160只,体重约250-300g,随机分为假手术对照组(n=40),模型组(n=40),丁苯酞大剂量组(n=40)(剂量为6mg/kg),丁苯酞小剂量组(n=40)(剂量为2mg/kg)。以2-Vo法制作血管性痴呆模型,分离大鼠双侧颈动脉,假手术对照组只分离不结扎,模型组、丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组永久结扎双侧颈动脉。丁苯酞注射液大剂量组和丁苯酞小剂量组于手术当日起即腹腔注射相应剂量的丁苯酞注射液,模型组腹腔注射等量的生理盐水,假手术组不给药。在给药后的1d、3d、5d、7d、14d和30d,在各时间点分别随机选取各组大鼠3只,经心脏灌注后断头取脑,于视交叉后1mm及4mm冠状切开脑组织,去除小脑和脑干,取中间海马组织,经固定、脱水、浸蜡、包埋制成石蜡切片,行免疫组化染色观察MMP-2及MMP-9的表达变化。各组剩余大鼠于给药后30d行跳台回避试验和Morris水迷宫试验,测试学习记忆能力,行HE染色观察海马病理变化。数据以均数士标准差(x士s )表示,运用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差的分析,采用LSD-t检验进行各组间两两的比较,P<0.05有统计学意义。结果1.实验动物的一般情况各组大鼠术后均出现毛发凌乱、活动减少、精神萎靡和少食少饮,术后麻醉苏醒时间和精神体能恢复时间,假手术对照组明显早于模型组,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组,而丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组明显早于模型组。假手术对照组术后1天即可恢复精神,丁苯酞治疗组约需2-3天,模型组最长,约5-7天左右恢复。2.跳台回避试验和Morris水迷宫试验各组大鼠于术后第31天测试跳台回避试验和Morris水迷宫试验作为学习成绩,各组大鼠于术后第32天测试跳台回避试验和Morris水迷宫试验作为记忆成绩。跳台试验以大鼠逃避潜伏期和错误次数作为学习成绩,潜伏时间和错误次数作为记忆成绩;Morris水迷宫试验以逃避潜伏时间和错误次数作为学习成绩,以停留原平台象限时间作为记忆成绩。2.1跳台试验的结果显示:在学习能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的跳台逃避潜伏期明显缩短,分别为(85.23±12.71,56.18±11.36,57.96±11.48)秒,错误次数明显减少,分别为(4.78±0.79,2.08±0.41,2.09±0.45);在记忆能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的潜伏时间明显延长,分别为(72.84±10.26,152.27±11.70,153.19±11.58)秒,错误次数明显减少,分别为(1.86±0.13,0.53±0.05,0.55±0.06)。2.2 Morris水迷宫试验的结果显示:在学习能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的跳台逃避潜伏期明显缩短,分别为(80.71±8.27,43.25±5.29,44.74±5.82)秒,错误次数明显减少,分别为(37.53±7.69,14.76±5.01,15.68±5.32);在记忆能力试验中,与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组的原平台象限时间明显延长,分别为(18.67±5.39,32.35±4.27,31.19±4.78)秒。3.各组大鼠海马HE染色假手术对照组:神经元变性坏死及细胞水肿不明显,细胞核大而圆,细胞排列紧密,与周围神经元界限清楚;模型组:神经元变性坏死及细胞水肿明显,核固缩,与周围神经元有明显水肿带;丁苯酞治疗组:神经元变性凋亡程度介于假手术组与模型组之间,神经元之间结构较清晰,无明显水肿带,受损神经元数量较模型组明显减少,丁苯酞大剂量组神经元受损的病理学表现较丁苯酞小剂量组为轻。4. MMP-2,MMP-9的免疫组化染色各组大鼠分别在术后的1d,3d,5d,7d,14d和30d以10%水合氯醛麻醉,断头取脑,4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行免疫组化染色,观察MMP-2,MMP-9表达的情况。用图象采集系统采图和图像分析软件对图像进行统计学分析。与模型组相比,丁苯酞大剂量组和丁苯酞小剂量组MMP-2,MMP-9在各时间点的表达明显减少,p<0.05,有统计学意义,表明丁苯酞可减少MMP-2及MMP-9的表达。结论:1.丁苯酞可改善VD模型大鼠在跳台回避试验和Morris水迷宫试验中的学习记忆能力。2.慢性脑缺血VD大鼠海马神经元的MMP-2及MMP-9的表达明显增加。3.丁苯酞可使海马神经元的MMP-2及MMP-9的表达明显减少。4.丁苯酞对MMP-2及MMP-9的表达的影响有可能是丁苯酞对VD的治疗作用的靶点之一。