基于三种碳源选择下的嗜盐混合PHA积累菌群多样性分析及其PHA合成能力优化

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聚羟基烷酸酯(PHA)是一种在营养不均衡条件下由微生物在细胞内合成的脂类物质。PHA在微生物的代谢过程中可起到积累碳源、平衡细胞内部与外部离子的作用。PHA的物化特性与聚丙烯等材料相似,没有毒害,在自然界中可以完全降解,是有望替代化学材料、解决白色污染的良好塑料。但是高的生产成本阻碍了PHA的规模化应用。通过研究开发混合菌替代传统的纯菌以廉价的有机物作为底物来生产PHA的途径可以降低PHA的生产成本。利用混合菌合成PHA受到了人们的广泛关注,然而在合成PHA的工艺方式上较为复杂,往往富集和驯化需要分为两个阶段或者是在不同的反应器内完成,造成总的工艺时间较长,PHA的合成效率较差。尽管目前对PHA合成的研究逐渐受到人们的重视,但是PHA的传统合成方法通常是通过淡水微生物来完成的,利用嗜盐活性污泥以不同底物合成PHA的研究还不多见。传统上通过两步法或者三步法生产PHA,即将PHA合成菌的富集与PHA的积累分为两步来完成。两步法由于过程操作复杂,而且由于两步中使用的水质不同造成在废水连续处理过程中无法应用。  本课题拟通过取自入海口野生底泥经驯化后,以三种不同的碳源作为底物通过SBR工艺以一步法连续生产的方式合成PHA。研究中考察了在三种碳源选择下的嗜盐PHA系统内的种群结构和在三种碳源下的系统中微生物合成PHA的能力,以及对三种碳源合成PHA产物的结构组成和热力学性质进行分析,为实现利用嗜盐混合菌合成PHA的工业应用提供理论依据。  以乙酸钠为碳源利用嗜盐混合菌合成PHA的研究。实验中考察了限制营养条件下对嗜盐污泥的驯化、PHA合成量的影响以及混合菌富集前后系统内种群的动态演替。结果表明利用嗜盐活性污泥通过限氮条件能定向驯化具有高积累能力的PHA合成菌,经过驯化得到最高PHA积累量可达到50%细胞干重。实验中设计在不同C/N比条件下来研究PHA的合成量的变化。结果表明,在一定范围内,PHA的合成量随着碳氮比的增高而增高,但是随着碳氮比的增高,PHA积累量达到最大所用的时间也随之增加;高碳氮比虽然利于PHA的合成,但是当碳氮比增加到一定水平时,PHB的合成速率不再随着碳氮比的增高丽增高。实验结束后,通过氯仿提取法得到纯净的PHA样品,利用傅立叶红外和核磁共振的方法对提取物进行了组分分析,发现以乙酸钠为底物,利用嗜盐活性污泥合成PHA的产物组分为单体PHB。分析富集前后微生物种群的变化,系统内的Pseudomonas菌具有合成PHA的能力。该菌在以乙酸钠为碳源的反应器中经过长时间的驯化由初始底泥中占0.03%升高至12.52%。PHA合成菌Methylosinus和Vibrio在以乙酸钠为碳源的反应器中没有得到有效的富集,系统内PHA的优势合成菌为Pseudomonas。  对嗜盐混合菌利用葡萄糖为碳源合成PHA的研究。经过对嗜盐活性污泥的驯化,系统内微生物合成PHA的量在22-35%细胞干重之间波动,其中单体HV组分含量在5-50%内波动。PHA的合成量受C/P比和盐度的影响,通过傅立叶红外及核磁共振方法对物质的结构进行分析。结果发现,利用嗜盐混合菌以葡萄糖为底物,采用SBR工艺合成的PHA为共聚物PHBV,与标准物具有相似的傅立叶红外和核磁共振谱图。实验中对共聚物PHBV样品进行了差热分析,样品的熔融点和热分解温度分别为153℃和250℃,相对于纯PHB样品,实验中得到的PHBV共聚物在热稳定性能上有了一定的提高。分析富集前后微生物种群的变化,系统内的PHA合成菌主要为Vibrio,该菌经过驯化由底泥中最初的0.1%增高至2.29%,为反应器中主要的PHA合成菌。另外系统内还存在少量的PHA合成菌Pseudomonas,其仅占总序列的0.01%。  实验中采用SBR好氧发酵的方式,以可溶性淀粉作为碳源,利用嗜盐活性污泥合成了PHA。实验中以高碳氮比为条件,对活性污泥进行定向驯化,得到具有PHA合成能力的微生物种群。经过50个周期的高碳氮比条件的驯化,细胞内积累PHA的含量达到30%左右。考察了不同C/N比条件下对PHA合成量的影响。结果表明,随着C/N比的升高,混合菌利用淀粉合成PHA的量没有明显的改变,在合成过程中淀粉不能有效的被微生物所分解利用。PHA合成结束后,对活性污泥中的PHA进行了提取,通过傅立叶红外和核磁共振对其组分和结构进行了分析。结果表明,通过嗜盐混合菌以淀粉为碳源合成得到的PHA为聚合物,主要单体为PHB,其含量大约占95%左右,HV单体含量仅5%左右。此外,对得到的共聚物PHBV样品的热力学特性进行了分析,样品的熔融点和热分解温度分别为169.8℃和266.11℃,相对于纯PHB样品,实验中得到的PHBV共聚物在热稳定性能上有了一定的提高。对富集前后微生物种群的变化进行分析发现在以淀粉作为底物的SBR反应器中,经过长时间的驯化,PHA合成菌为Vibrio,占总序列的比例为1.96%。
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