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研究背景
高血压病(Hypertension)是我国人民患病率最高的慢性非传染性疾病之一,由高血压引起的急性或慢性靶器官损害,如高血压急症、心脑血管疾病等是导致人类死亡的第一杀手。动脉功能和结构损害是高血压病及其相关重要靶器官损伤的共同病理基础,此外研究证实,内皮功能障碍(endothelial dysfunction)也是启动动脉粥样硬化过程的始动环节。
Ghrelin是1999年由Kojiima等从大鼠胃粘膜细胞分离纯化得到的一种由28个氨基酸组成的内源性促生长激素释放肽,也广泛存在于体内的其它组织中,如心血管组织,与生长激素促分泌物质受体GHSR各亚型结合后,产生多种生物学效应。Ghrelin不仅能有效地促进生长激素(GH)分泌,还能调节内分泌、促进摄食、增加体重、调节能量代谢平衡改善恶病质状态,降低血管紧张改善血流动力学,调节血压,还能抑制心肌细胞及内皮细胞凋亡,这就提示ghrelin可能成为治疗心血管疾病如心衰、高血压、动脉粥样硬化的又一新靶点。
高同型半胱氨酸血症(HHcy)是心脑血管疾病的独立危险因素。有研究表明,血压患者血浆Hcy水平显著高于正常人群,且其水平随年龄增大而增加。目前高Hcy血症与高血压患者血管内皮功能受损的关系尚有争议。血管内皮依赖舒张作用减弱,收缩作用增强是高血压致内皮功能障碍的表现之一,高血压患者中血浆NO、vWF等血管内皮标志物有不同程度的改变,但这些标志物能否反映内皮依赖性血管舒张功能还不十分明确。本研究旨在通过检测高血压患者和健康志愿者血浆中的ghrelin、homocysteine水平,动脉弹性、内皮舒张功能及损伤标志物,评估ghrelin,homocysteine与血压及血管内皮功能之间的关系,探讨对高血压内皮损伤机制有较深入的了解。
我们课题组已经用蛋氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症(HHcy)建立起比较成熟的Hcy致内皮损伤动物模型,并在造模型过程中给予中药复方通心络(TXL)或者单味人参皂甙(RS)在体治疗,表明两者均有抗Hcy内皮损伤及扩血管的作用；人参皂甙Rb1能抗Hcy诱导的猪冠状动脉内皮功能障碍,且与一氧化氮(NO)通路有关；ghrelin是一种新的血管活性肽,其在心血管组织中广泛表达,最近发现ghrelin也能通过NO通路来抗Hey诱导的猪冠状动脉内皮功能障碍；故ghrelin在血管病变中的作用及其是否介导了通络代表药物人参皂甙Rb1保护血管内皮作用的分子机制,需做进一步的研究。
本研究分二章。
一、高血压患者血浆ghrelin多肽及同型半胱氨酸与血管内皮功能的关系探讨-高血压综合防治研究(CHIEF)子项目
目的:高血压时存在血管内皮细胞功能障碍,心血管活性肽ghrelin具有改善能量代谢调节血压及保护内皮的作用,高同型半胱氨酸血症是脑血管疾病的独立危险因素,Hcy可以损伤血管内皮细胞、导致内皮功能障碍,目前有关ghrelin、Hcy及内皮功能三者间的关系的资料较零散。本研究检测高血压患者血浆ghrelin及同型半胱氨酸(homocystine,Hcy)与血管内皮相关指标,通过相关及回归分析,探讨原发性高血压患者血管内皮损伤及保护机制。方法:选取高血压患者37例和血压正常健康志愿者41例,采集完临床资料并分别测定血浆血糖、血脂、NO、vWF、ghrelin和Hcy水平；采用高分辨率彩超检测肱动脉血流介导的内皮依赖性(FMD)和非内皮依赖性血管舒张功能(NMD),用脉搏波形分析法检测大小动脉弹性指数(C1和C2)。结论:高血压发病过程中,血浆高ghrelin水平升高与血管内皮依赖舒张功能密切相关,很可能其潜在的增强NO生物活性有关,Hcy水平升高与脂质代谢异常有关,但是ghrelin与Hcy之间并没有明显相关。
二、人参皂甙Rb1对同型半胱氨酸诱导大鼠内皮损伤及ghrelin多肽表达的影响
目的:报道表明人参皂甙Rb1能抗Hcy诱导的血管内皮功能障碍,且与一氧化氮(NO)通路有关,Ghrelin多肽及其受体广泛分布于心血管组织,也可通过NO通路来扩血管及保护血管内皮,故本研究分别从体内体外实验来探讨内源性ghrelin多肽足否介导了通络代表药物人参皂甙Rbl保护内皮的作用。方法:在体实验用高蛋氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症建立Hcy致内皮损伤动物模型,将大鼠分为正常组(Control)、高同型半胱氨酸模型组(Hcy)、同型半胱氨酸+人参组(Hcy+RS)及人参单独处理组(RS),药物干预后,ELISA法检测血浆ghrelin水平；主动脉环技术检测血管内皮依赖性舒缩功能；HE染色观察血管环组织结构变化。离体实验取新生胎儿脐带行脐静脉内皮细胞培养,实验分为正常组(Control)、不同剂量Hcy诱导的内皮细胞损伤模型组(Hcy)、人参皂甙Rb1不同剂量及不同预处理时间组(Rb1),根据NO释放水平确立实验最佳条件,药物干预后,硝酸还原法检测上清NO含量；ELISA法检上清ghrelin及vWF水平并行直线相关回归分析；细胞免疫组化法观察ghrelin及eNOS蛋白表达。Ghrelin受体拮抗剂实验结束后,用DFA-2 DA荧光探针法观察抑制ghrelin对HUVECs内NO含量的影响。结论:ghrelin具有改善Hcy诱导的血管内皮舒张功能障碍及结构损伤,在Hcy致内皮损伤模型中血浆ghrelin水平代偿性升高可能是对损伤的一种保护性反应,通络代表药物人参皂甙能显著激发内源性ghrelin水平释放进而发挥保护血管内皮的作用。此外,人参皂甙Rb1可通过上调Hcy诱导降低的eNOS/NO途径来保护内皮细胞,且这种作用很可能足其通过影响内皮细胞表达自分泌ghrelin多肽介导的。
结论
1、(临床研究)本实验发现高血压患者血浆中ghrelin及Hcy水平与血压、传统的心血管危险因素、血管内皮功能有明显相关性,尽管本研究中高血压病人的血浆ghrelin及Hcy水平均显著升高,ghrelin与NO显著相关,但是ghrelin与Hcy之间,NO与Hcy之间均无明显相关。高血压的发生发展过程中,Hcy是否是血管内皮损伤的独立危险因子及通过ghrelin水平是否能预测血压变化仍需要继续研究。
2、(动物实验)在体用高蛋氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症(HHcy)建立内皮损伤动物模型,并给予人参总皂甙或ghrelin干预。结果表明外源性ghrelin具有增强内皮依赖的血管舒张功能,减轻Hcy诱导的内皮损伤促血管修复的作用。内源性血浆ghrelin水平在Hcy诱导的内皮损伤模型中升高可能是机体的一种代偿性抗损伤反应,人参皂甙治疗组与对照组相比,前者能明显激发大鼠机体内源性ghrelin水平的释放。
3、(细胞实验)人参皂甙Rb1通过促进内皮细胞表达自分泌ghrelin多肽水平,进而通过上调Hcy诱导降低的eNOS/NO途径来发挥保护内皮细胞的作用。
创新点
1、在高血压人群整体水平上初步分析了血浆Hcy、ghrelin水平及血压及内皮功能之间的相关性,探讨了高血压时内皮功能障碍的潜在机制。
2、发现内皮细胞也具有合成和分泌ghrelin多肽的功能。通过自分泌/旁分泌方式来参与内皮细胞保护作用,从而为本实验假说建立工作基础。
3、提出并证明了“内源性ghrelin介导了人参皂甙Rb1改善HHcy致内皮损伤的分子机制及eNOS/NO信号途径”的假说。