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共焦显微成像技术具有很高的空间分辨率和特有的层析成像能力,因而在生物医学研究、三维高密度存储以及三维微细加工等领域具有广泛的应用,并取得了许多突破性进展,特别是在生物医学研究领域,可以实现对活细胞、细胞组织甚至生物大分子等微小物体进行动态的高分辨率三维成像,已成为生物医学研究领域非常有效的研究手段。然而,共焦显微成像技术是采用物体的散射光或荧光进行成像,它获得的仅仅是被观察物体的结构图像,无法获得细胞或生物大分子的功能图像。
而光声成像技术是利用光声信号进行成像,由于光声信号与生物组织的光学、热学和声学特性有关,因此光声信号所携带的信息量远远多于散射光和荧光所携带的信息量,可以获得生物组织的生物学行为(如代谢、病变等)特征信息,从而实现生物功能成像。然而,由于目前光声成像技术的分辨率还比较低,只能达到10微米的分辨率,无法观察细胞水平的结构图像。
本论文提出将激光扫描、光声显微成像技术、共焦显微成像技术相结合的方法进行双模显微成像,实现对观察物体同时进行共焦显微成像和光声显微成像,并通过双模图像对比,从而获得生物组织的功能图像。
本文的主要工作如下:
第一,分别从光声效应的原理以及共焦的原理出发,研究光声信号及共焦信号的产生过程,由此提出以连续激光器为光源,采用斩波器进行调制,并采用微腔光声探测器的设想,由此而最终确定了双模显微成像的方案。
第二、基于上述原理,本课题组设计了激光扫描光声—共焦双模显微成像系统,其硬件部份大概可以分为以下3部份:激光扫描系统、光学显微平台、信号探测采集系统。其中,激光扫描系统是由振镜控制模块及振镜组成,可以实现微米数量级的光速的二维扫描；光学显微平台主要包括了显微物镜转换器、三维可调的载物平台,可以实现微米级的调试；信号探测采集系统主要包括:微腔光声探测器、前置放大器、锁相放大器、斩波器、针孔、光声探测器、数据采集卡组成,能够实现了对细胞光声信号及共焦信号的采集。利用LabVIEW平台开发软件控制系统,主要实现功能有:振镜控制、数据采集、处理、重建图像等。
第三,完成了对整个激光扫描光声-共焦双模显微系统的搭建及其调试。我们的系统主要由风冷AR离子激光器、激光扫描光声显微镜、微腔光声探测器、锁相放大器、斩波器、前置放大器、振镜驱动器、透射针孔、光电倍增管、数据采集卡、计算机以及示波器构成。在调试好系统及光路后,设定系统参数,首先对系统的分辨率进行了分析,验证本系统达到了1.25μm的生物组织分辨率水平。然后对正常的血红细胞进行了双模成像,所得图像结构清晰,具有很高的对比度,与在光学显微镜下的样品结构一一对应；接着,利用此技术,对蒜根尖的有丝分裂过程进行成像,实现了系统的亚细胞成像。在此基础上,还进行了损伤细胞及贫血细胞的功能成像实验,所得图像结构清晰,并且所成的显微图像能利用自编的程序通过判断缺铁性贫血细胞的中央淡染区的面积大小,以此来作贫血程度的初步判断,对临床医学具有应用价值。