论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由 PRRSV引起的一种以母猪流产、早产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍及各阶段猪呼吸道症状为特征的传染病。自1996年国内首次报道该病以来,我国养猪行业长期受到PRRS的影响,尤其是2006年暴发的高致病性PRRSV给中国养猪行业带来了巨大打击。目前,我国主要流行6种类型的Ⅱ型 PRRSV,分别为 Sublineage 1.8(类 NADC30 毒株)、Sublineage 1.5(类 NADC34毒株)、Sublineage 3.5(类 QYYZ 毒株)、Sublineage 5.1(类 Resp-PRRS MLV 毒株)、Sublineage 8.7(HP-PRRSV)和Lineage 9,其中类NADC30和HP-PRRSV毒株是我国主要流行毒株。河南地处中原、交通便利,作为我国重要的生猪养殖和调运大省,面临更为严峻的动物疫病输入和传播风险。目前的研究结果显示,类NADC30毒株是河南地区主要流行毒株,该类毒株在猪群中不断变异,给PRRS防控带来极大困难。类NADC30毒株防控难点主要存在两个方面,一方面是不同毒株之间的同源性比较低,不同地区、不同猪场的毒株相似性差异也比较大;另一方面是从目前的研究结果显示,绝大多数检测到的类NADC30毒株都存在一定的基因重组,且重组模式复杂多样,给PRRS流行病学研究以及病毒遗传进化规律带来很大阻力。本研究通过对河南18个地市进行PRRSV分子流行病学调查,初步了解了河南地区PRRSV毒株的流行与分布情况,并基于PRRSV容易发生变异这一特点,对河南某规模化养猪场进行长期的调查与研究,在封闭条件下对该猪场内流行的PRRSV毒株进行跟踪监测与分析,以期了解该猪场PRRSV的流行动态。从横向调查到纵向跟踪,由面及点,进一步研究PRRSV毒株的遗传进化规律与变异规律,为PRRS的临床诊断、防控以及疫苗研发提供更有效的科学依据。1.2018-2019年河南省PRRSV流行情况为了解河南地区PRRSV的流行特点及变异规律,本研究对2018-2019年采自河南18个地市94个猪场的613份疑似PRRS临床样品(猪肺脏、脾脏和淋巴结的组织)进行RT-PCR检测,并对检测确诊的阳性样品进行ORF5和NSP2基因扩增、序列测定并进行遗传进化分析。结果显示:613份样品中共检测出PRRSV阳性样品151份,阳性率为24.63%;其中,豫北地区检出率最高;从151份阳性样品中扩增得到83个ORF5和31个NSP2基因序列;基于83株PRRSV ORF5基因序列遗传进化分析表明,83株PRRSV中有74株PRRSV属于类NADC30毒株,6株PRRSV属于华南地区流行毒株类QYYZ毒株,3株与PRRS商品化活疫苗基因序列高度同源。74株类NADC30毒株ORF5 基因推导的氨基酸序列比对结果发现,各毒株之间ORF5基因氨基酸序列同源性差异较大,其中有10株毒株的ORF5序列在高变区存在插入或缺失。31株PRRSV NSP2基因推导的氨基酸序列比对结果发现,29株PRRSV的NSP2序列存在131位不连续氨基酸缺失,1株PRRSV的NSP2序列与高致病性PRRS疫苗株JXA1-R存在相同缺失,1株PRRSV的NSP2序列与经典疫苗毒株RespPRRS MLV相似性为99%。由此表明,2018-2019年河南地区PRRSV以类NADC30毒株为优势毒株,且NSP2和ORF5基因发生变异较大;同时类QYYZ毒株在河南的出现和PRRSV活疫苗的不断检出使PRRSV的流行更加复杂。因此,加强对PRRSV的流行变化及遗传变异的持续监测尤为重要,本研究可为PRRS临床诊断、防控以及疫苗研发提供有效的临床依据。2.河南省某规模化养殖场PRRSV的跟踪监测为进一步了解PRRSV在特定养殖场的演化与变异规律,本试验于2017-2019年定期对河南某规模化养殖场进行PRRSV的监测。通过对不同月份采自该场的疑似PRRSV样品进行RT-PCR检测,并对检测的阳性样品进行ORF5、NSP2以及全基因序列扩增,获取的毒株序列信息进行遗传进化分析、核苷酸相似性比较、编码蛋白糖基化位点预测以及重组分析。共获得46株PRRSV序列信息,基于ORF5基因的遗传进化分析结果表明,该养殖场检测到的毒株均为类NADC30毒株,属于Sublineage1.8,结合ORF5基因推到的氨基酸变异分析情况,将所有检测到的毒株细分为5组(A-E),同组之间毒株在ORF5基因上的氨基酸变异情况相似。分析发现各组毒株存在养殖场时间越长,其组内毒株之间的遗传距离越大;且发现B组和D组毒株之间ORF5基因有相同的氨基酸变异位点,提示这两组之间PRRSV变异过程存在一定联系。GP5蛋白糖基化位点的分析结果显示,各组毒株在GP5蛋白上的糖基化位点均发生了一定的增多或位移。10株PRRSV NSP2基因推导的氨基酸序列比对结果发现,10株PRRSV的NSP2序列均存在131位不连续氨基酸缺失。此外,通过对扩增得到的SP41810-30毒株和SP41904-39毒株的全基因进行重组分析发现,两株毒株均发生NADC30毒株与JXAl-P100毒株的重组,且存在相同的重组模式。本试验揭示了规模化养殖场PRRSV的持续传播与遗传演变特征,为PRRSV变异与重组机制以及免疫防控提供了一定参考。3.PRRSV河南流行毒株的分离与鉴定为研究PRRSV田间流行毒株生物学特性,本试验将50份PRRSV阳性组织样品处理液接种于Marc-145细胞中,盲传3代后进行RT-PCR鉴定和间接免疫荧光试验,对成功分离的PRRSV毒株进行全基因扩增、遗传进化分析和变异分析。结果成功分离到2株PRRSV毒株,分别命名为HENSQ-3和HENXX-12,全基因组大小分别为15319bp和15014bp;两株PRRSV第5代病毒在Marc-145细胞上的感染滴度分别为106.33TCID50/ml和1 05.15TCID50/ml。通过遗传进化分析发现,HENSQ-3 属于 Sublineage8.7(HP-PRRSV),核苷酸序列与JXAl毒株高度同源,相似性达98.6%;HENXX-12为类NADC30毒株,与NADC30毒株的相似性为93.6%。重组分析发现,HENXX-12是以NADC30毒株为主要亲本和高致病性性毒株HK13为次要亲本的重组毒株,重组结点为5743bp-6378bp。本试验为研究PRRSV的遗传演化与致病性研究等方面提供了参考。